趙百學(xué)，陳建華

尿酸酶是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的一種氧化酶，廣泛分布于自然界多種物種體內(nèi)，主要介導(dǎo)尿酸氧化降解的酶促反應(yīng)[1-3]。自然界內(nèi)的絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物具有功能型尿酸酶，而部分靈長(zhǎng)類（大型猿類、人類）尿酸酶基因由于進(jìn)化中突變事件而成為假基因不能表達(dá)功能型尿酸酶，因此后者血清內(nèi)尿酸水平比前者高 3～10 倍[4-5]，這也是人類是唯一容易罹患痛風(fēng)的哺乳動(dòng)物的主要原因。近年來(lái)痛風(fēng)在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而臨床上的治療藥物比較匱乏[6]。尿酸酶類藥物可以快速降解人血清中尿酸從而有效地治療痛風(fēng)，但是目前臨床上使用的均是外源性尿酸酶，強(qiáng)烈的免疫原性限制了其使用[7]。研究靈長(zhǎng)類尿酸酶基因失活的機(jī)制從而恢復(fù)其活性對(duì)于低免疫原性抗痛風(fēng)藥物的開(kāi)發(fā)無(wú)疑是一條新思路。目前，靈長(zhǎng)類尿酸酶失活的分子機(jī)制還不清楚，本文就靈長(zhǎng)類尿酸酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、進(jìn)化失活與自然選擇及其失活的分子機(jī)制研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 尿酸酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究

不同物種尿酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)差異比較大，氨基酸數(shù)目和同源性都不盡相同，但是高級(jí)結(jié)構(gòu)則相對(duì)保守。目前研究人員已經(jīng)成功對(duì)黃曲霉菌和球形節(jié)桿菌的尿酸酶進(jìn)行結(jié)晶，并且在不同分辨率層次上獲得了結(jié)構(gòu)模型[8-9]。哺乳動(dòng)物尿酸酶由于可溶性差導(dǎo)致結(jié)晶困難，因此尚未得到哺乳動(dòng)物尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)。從現(xiàn)有的微生物尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)可以看出，尿酸酶活性形式是同源四聚體（圖 1），具有四個(gè)相同的活性中心，活性中心位于二聚體的界面處[10]。每個(gè)尿酸酶單體由兩個(gè)對(duì)稱的 T-fold 結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成，兩個(gè)尿酸酶單體通過(guò)氫鍵結(jié)合形成桶狀的二聚體結(jié)構(gòu)，兩個(gè)二聚體再通過(guò)氫鍵形成活性形式的四聚體尿酸酶。二聚體的界面處通過(guò)疏水氨基酸的相互作用形成口袋狀的疏水核心，該結(jié)構(gòu)是尿酸酶的活性中心負(fù)責(zé)底物的定位和 O2的結(jié)合[11-14]。

哺乳動(dòng)物的尿酸酶也是保守的同源四聚體結(jié)構(gòu)，與微生物尿酸酶整體結(jié)構(gòu)差異不大，而相鄰單體形成二聚體時(shí)的環(huán)形構(gòu)象則差異很大，但是活性位點(diǎn)的氨基酸殘基則高度保守。Kratzer 等[15]通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物尿酸酶的進(jìn)化史進(jìn)行分析構(gòu)建出了高活性的哺乳動(dòng)物祖先尿酸酶，結(jié)合多物種尿酸酶蛋白序列比對(duì)，推測(cè)出從祖先尿酸酶到現(xiàn)今的人尿酸酶進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了 22 個(gè)對(duì)酶活性有害氨基酸錯(cuò)義突變位點(diǎn)。

Kratzer 的研究結(jié)果顯示，Phe222/Ser232/Tyr240 這3 個(gè)氨基酸殘基對(duì)于祖先尿酸酶活性中心的 α4-α5 元件的形成至關(guān)重要，若發(fā)生錯(cuò)義突變則會(huì)導(dǎo)致底物尿酸不能在活性位點(diǎn)正確定位。S232L 置換后喪失與 Gly169 形成氫鍵的能力，從而導(dǎo)致 Phe170 和 Gln236 空間取向錯(cuò)誤和活性中心不能正確形成，最終導(dǎo)致底物不能在活性中心正確定位。Y240C 的置換導(dǎo)致活性中心附近的疏水氨基酸不能正常折疊進(jìn)而影響二聚體的正確締合。P222A 的置換導(dǎo)致活性中心的極性增強(qiáng)從而影響疏水口袋的形成和二聚體之間的相互作用。此外，其他的 19 個(gè)氨基酸的置換也都會(huì)影響尿酸酶的折疊和活性中心的形成。

圖1 黃曲霉尿酸酶晶體結(jié)構(gòu)模型[10]（A：黃曲霉尿酸酶同源四聚體模型；B：黃曲霉尿酸酶單體結(jié)構(gòu)模型）

2 尿酸酶失活與古靈長(zhǎng)類進(jìn)化

多項(xiàng)研究表明靈長(zhǎng)類尿酸酶的失活對(duì)于古靈長(zhǎng)類的進(jìn)化具有選擇優(yōu)勢(shì)。最新的研究表明哺乳動(dòng)物在果糖的存在下，尿酸可以促進(jìn)機(jī)體脂肪的積累[16]。靈長(zhǎng)類的尿酸酶失活起始于始新世，到中新世的初期徹底失活。在地質(zhì)窗口期全球氣候逐漸變冷，古靈長(zhǎng)類可以獲得的果實(shí)性食物逐漸減少。此時(shí)尿酸酶的失活使得其體內(nèi)尿酸水平升高，促進(jìn)古靈長(zhǎng)類從植物果實(shí)中攝取的果糖在肝臟中轉(zhuǎn)化成脂肪并儲(chǔ)存下來(lái)，而脂肪的積累可以幫助古靈長(zhǎng)類度過(guò)地球寒冷的食物匱乏期[17-18]?，F(xiàn)代人類生活條件的改善使得人均果糖日攝取量遠(yuǎn)高于古靈長(zhǎng)類，同時(shí)由于尿酸酶失活導(dǎo)致血清尿酸水平升高，因此肥胖癥在全球范圍內(nèi)流行。這也間接表明了尿酸酶的失活對(duì)于古靈長(zhǎng)類度過(guò)地球地質(zhì)窗口期具有進(jìn)化優(yōu)勢(shì)。

在始新世的早期，地球氣候溫暖，古靈長(zhǎng)類可以獲得較多的果實(shí)性食物，該類食物中含有豐富的抗壞血酸（Vc）。Vc 是一種有效的抗氧化劑可以維持靈長(zhǎng)類體內(nèi)的抗氧化水平，因此始新世早期的古靈長(zhǎng)類沒(méi)必要通過(guò)浪費(fèi)自身能量合成 Vc。在這一時(shí)期 Vc 合成途徑最后一步反應(yīng)催化酶基因失活成為假基因?qū)е鹿澎`長(zhǎng)類不再合成 Vc[19-20]，這也是基因節(jié)儉學(xué)說(shuō)的有力證據(jù)。始新世后期地球氣候逐漸變冷，古靈長(zhǎng)類可獲得的果實(shí)性食物減少，為了維持體內(nèi)足夠的抗氧化水平，在這一時(shí)期古靈長(zhǎng)類尿酸酶失活使體內(nèi)尿酸水平升高。尿酸是有效的抗氧化劑，有效地補(bǔ)償了古靈長(zhǎng)類體內(nèi)Vc 合成途徑的缺失。

另外，尿酸與咖啡因具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以刺激大腦皮層的應(yīng)激反應(yīng)[21]，因此推測(cè)靈長(zhǎng)類的尿酸酶失活促進(jìn)古靈長(zhǎng)類智力的進(jìn)化[22]。尿酸在靈長(zhǎng)類體內(nèi)還具有提高血壓的作用，古人類向現(xiàn)代人進(jìn)化時(shí)直立行走需要較高的血壓維持腦部供血，因此推測(cè)尿酸酶失活促進(jìn)古靈長(zhǎng)類直立行走能力的進(jìn)化。

3 靈長(zhǎng)類尿酸酶失活的分子機(jī)制

靈長(zhǎng)類尿酸酶失活的分子機(jī)制還不清楚，研究人員使用RNA 雜交的方法在人肝臟細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到了尿酸酶基因的轉(zhuǎn)錄體，對(duì)其 cDNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)在 33 和 187 位密碼子發(fā)生了無(wú)義突變，但是消除這兩個(gè)無(wú)義突變依然不能恢復(fù)人尿酸酶活性[23]，可見(jiàn)尿酸酶失活是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。目前關(guān)于靈長(zhǎng)類尿酸酶失活機(jī)制的主流觀點(diǎn)是：靈長(zhǎng)類尿酸酶失活是漸進(jìn)性活性下降的過(guò)程。研究人員曾對(duì)小鼠的尿酸酶基因進(jìn)行基因敲除，該敲除型小鼠血清尿酸水平較正常小鼠急劇升高，并很快死于高尿酸型腎病，但是通過(guò)喂服尿酸生成抑制藥物則可以延長(zhǎng)該類小鼠的壽命[24]。因此這也間接表明靈長(zhǎng)類尿酸酶失活更可能是漸進(jìn)性進(jìn)化事件。

學(xué)術(shù)界對(duì)于靈長(zhǎng)類尿酸酶漸進(jìn)性失活機(jī)制也有分歧。一部分研究人員認(rèn)為靈長(zhǎng)類尿酸酶失活首先發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)序列突變導(dǎo)致尿酸酶的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，宏觀表現(xiàn)為古靈長(zhǎng)類體內(nèi)尿酸酶活性下降[25]。另外一部分研究人員認(rèn)為靈長(zhǎng)類尿酸酶失活首先發(fā)生在編碼區(qū)，編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生多個(gè)有害的氨基酸突變導(dǎo)致其活性的逐步降低最終沉默成為假基因。多項(xiàng)研究表明古靈長(zhǎng)類尿酸酶編碼區(qū)首先發(fā)生活性有害突變更可能是靈長(zhǎng)類尿酸酶失活的機(jī)制[15,26]。Kratzer 等[15]分析了哺乳動(dòng)物尿酸酶進(jìn)化史，通過(guò)構(gòu)建哺乳動(dòng)物祖先尿酸酶及其突變體來(lái)模擬哺乳動(dòng)物尿酸酶的進(jìn)化軌跡。從圖 2可以看出哺乳動(dòng)物祖先尿酸酶基因編碼區(qū)逐漸發(fā)生突變導(dǎo)致其活性降低，靈長(zhǎng)類尿酸酶的失活起始于古猿類祖先的形成，即 15.7 Ma（百萬(wàn)年）。人尿酸酶假基因含有 3 個(gè)明顯的有害突變：33 位密碼子無(wú)義突變（猩猩、大猩猩、黑猩猩、人類共有）；187 位密碼子無(wú)義突變（人類、黑猩猩共有）；2 號(hào)內(nèi)含子序列剪切受體位點(diǎn)異常突變（人、黑猩猩共有）。而長(zhǎng)臂猿尿酸酶假基因在 2 號(hào)外顯子有 12 bp 的堿基缺失導(dǎo)致移碼突變并且在 18 號(hào)密碼子處發(fā)生無(wú)義突變，因此是獨(dú)立的進(jìn)化事件。

圖2 尿酸酶基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化以及古老尿酸酶酶活性特點(diǎn)[15]（An19～An33：哺乳動(dòng)物尿酸酶的進(jìn)化軌跡。[ ]中的數(shù)字表示上一級(jí)物種尿酸酶進(jìn)化到下一級(jí)物種尿酸酶發(fā)生突變的數(shù)目；2,411～< 10 表示尿酸酶的特異性；7.08×105*～n.d.表示尿酸酶催化效率）

Zhang 等[26]通過(guò)構(gòu)建人-犬尿酸酶嵌合體、序列比對(duì)和同源模建分析了靈長(zhǎng)類尿酸酶的進(jìn)化機(jī)制，他們認(rèn)為古靈長(zhǎng)類尿酸酶首先在 119 位發(fā)生錯(cuò)義突變使其活性降低，然后發(fā)生了 33 位無(wú)義突變使其徹底沉默，這也印證了靈長(zhǎng)類尿酸酶漸進(jìn)性失活突變的推測(cè)。另外與微生物相比，哺乳動(dòng)物尿酸酶高頻率的使用 CGA 編碼精氨酸，而導(dǎo)致發(fā)生終止突變的概率增加（CGA-TGA），這可能暗示了哺乳動(dòng)物尿酸酶具有失活的趨勢(shì)，同時(shí)這也與物種進(jìn)化的程度相符合。

4 靈長(zhǎng)類尿酸酶失活與現(xiàn)代人疾病

人尿酸酶假基因在肝臟細(xì)胞中可以轉(zhuǎn)錄，但是由于 33和 187 號(hào)密碼子的無(wú)義突變，因此不能正常表達(dá)功能型尿酸酶，并且由于無(wú)義突變的摻入導(dǎo)致人尿酸酶轉(zhuǎn)錄體也不穩(wěn)定。研究人員曾糾正這兩個(gè)無(wú)義突變，但是未能恢復(fù)尿酸酶的活性。靈長(zhǎng)類尿酸酶蛋白編碼區(qū)在進(jìn)化中還發(fā)生多個(gè)有害突變導(dǎo)致不能形成活性形式的四聚體。由于人尿酸酶的假基因化而不能表達(dá)功能型尿酸酶，因此人體內(nèi)具有更高的血清尿酸水平。過(guò)高的尿酸水平會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥，長(zhǎng)期的高尿酸血癥會(huì)形成痛風(fēng)[27]。痛風(fēng)的形成與多種因素有關(guān)，如：過(guò)食富含嘌呤的食物、酗酒、年齡、性別等[28]。隨著生活水平的提高，痛風(fēng)在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年升高。長(zhǎng)期高尿酸血癥還會(huì)形成腎結(jié)石。腫瘤患者化療后，大量的細(xì)胞死亡釋放出大量的 DNA 和 RNA 使患者體內(nèi)尿酸水平急劇升高，若不加處理則會(huì)導(dǎo)致急性腎衰竭[29]。人體內(nèi)長(zhǎng)期高位的尿酸水平也與代謝綜合征、心血管疾病的發(fā)病有關(guān)。因此，靈長(zhǎng)類尿酸酶失活曾經(jīng)對(duì)于古靈長(zhǎng)類的進(jìn)化具有選擇優(yōu)勢(shì)，但是現(xiàn)今則更容易使人類罹患痛風(fēng)等疾病，而開(kāi)發(fā)尿酸酶藥物則可以有效地補(bǔ)償人尿酸酶的缺失造成的相關(guān)疾?。ㄍ达L(fēng)、高尿酸血癥、代謝綜合征等）。

5 國(guó)內(nèi)外尿酸酶藥物的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀與趨勢(shì)

目前，臨床上治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物比較匱乏，并且長(zhǎng)期使用后產(chǎn)生的嚴(yán)重副作用會(huì)降低患者的依從性甚至停用。尿酸酶類藥物可以快速降低血清尿酸水平，甚至溶解已經(jīng)形成的痛風(fēng)石，具有其他化學(xué)藥物難以比擬的優(yōu)點(diǎn)。但是，臨床上使用的尿酸酶類抗痛風(fēng)藥物均是外源性治療蛋白，無(wú)法避免的免疫原性限制了其在痛風(fēng)治療中的應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于復(fù)活人尿酸酶或者構(gòu)建人-哺乳動(dòng)物嵌合尿酸酶進(jìn)行了大量研究以期開(kāi)發(fā)出低免疫原性的尿酸酶藥物，而且結(jié)果表明這種方式具有很好的可行性。

目前已經(jīng)上市的尿酸酶藥物有豬-狒狒尿酸酶嵌合體（pegloticase）和重組黃曲霉尿酸酶兩種[30-31]，而國(guó)內(nèi)還沒(méi)有進(jìn)入臨床的尿酸酶類藥。Pegloticase 主要用于難治性痛風(fēng)的治療，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)（發(fā)熱、胃腸道不適等），后者主要用于腫瘤崩解綜合征的治療。當(dāng)前，國(guó)外主要集中于靈長(zhǎng)類尿酸酶復(fù)活與哺乳動(dòng)物-靈長(zhǎng)類尿酸酶嵌合體的研究，其主要目的是在保持較高的酶活性前提下盡可能地提高與人尿酸酶的同源性，可以看出與人親緣關(guān)系更近的尿酸酶藥物則更具開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。其中，F(xiàn)DA 在 2010年批準(zhǔn)的 pegloticase 比較巧妙地利用了豬尿酸酶高活性和狒狒尿酸酶與人高親緣性的特點(diǎn)。Fan 等[32]研究了人與犬尿酸酶的嵌合體，該嵌合體尿酸酶在特定的位置進(jìn)行氨基酸置換修飾，初步研究表明具有更好的穩(wěn)定性和藥理活性。還有研究人員在研究人尿酸酶復(fù)活的過(guò)程中獲得一些與人尿酸酶高度同源的（> 90%）尿酸酶突變體，這些突變體具有較高的酶活性，并且可以使用 PEG 修飾的手段進(jìn)一步降低免疫原性[33]。

目前，用于痛風(fēng)治療的尿酸酶藥物開(kāi)發(fā)一般基于對(duì)哺乳動(dòng)物尿酸酶 PEG 修飾，但是 PEG 修飾后一般會(huì)造成酶活性的較大損失，并且長(zhǎng)時(shí)間使用 PEG 修飾蛋白，修飾用的PEG 也會(huì)誘導(dǎo)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。因此，目前臨床使用的尿酸酶藥物最大的局限性便在于難以避免的免疫原性。所以，進(jìn)一步研究靈長(zhǎng)類尿酸酶失活機(jī)制，復(fù)活人尿酸酶或研發(fā)與人尿酸酶親緣更近的高活性尿酸酶是開(kāi)發(fā)低免疫原性尿酸酶藥物的重要方向。

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