吳鳳麟，韋嘉灝，賈筠，何免，邵紅偉，黃樹林

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一種基于TIL的腫瘤相關(guān)抗原特異性T細胞的篩選方法

吳鳳麟，韋嘉灝，賈筠，何免，邵紅偉，黃樹林

510006 廣州，廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院（吳鳳麟、韋嘉灝、何免、邵紅偉、黃樹林），生物制藥研究所（吳鳳麟、邵紅偉、黃樹林），廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室（吳鳳麟、邵紅偉、黃樹林）；523059 東莞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（賈筠）

Wolfl 等[1]的研究建立了一種以 CD137 為表面標(biāo)記，從人 CD8+T 細胞中快速鑒定和分離抗原特異性 T 細胞的方法。由于 CD137 分子表達于活化的 CD4+和 CD8+T 細胞表面[2]，其表達上調(diào)依賴于 T 細胞經(jīng)抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后 12 h ~ 5 d 內(nèi)持續(xù)表達[3]。因此可以 CD137 為標(biāo)記，從 T 細胞中檢測和分離比例較低的抗原特異性 T 細胞。

上述研究主要從健康人外周血單核細胞（peripheral blood monocyte，PBMC）中篩選 CD137+抗原特異性 T 細胞。然而由于成熟的外周血 T 細胞經(jīng)歷了胸腺的陰性選擇，其 T 細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）對自身抗原肽（接近腫瘤抗原肽）/MHC 復(fù)合物的親和力低下[4]，限制了以健康人 PBMC 篩選腫瘤抗原特異性 T 細胞的效率。因此，有必要尋找更理想的腫瘤抗原特異性 T 細胞篩選來源，這一來源應(yīng)較為確定地含有可識別腫瘤相關(guān)抗原的 T 細胞亞群。

國外臨床研究結(jié)果提示，腫瘤局部浸潤的記憶性 T 細胞數(shù)量，與患者的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有明顯相關(guān)性[5]。提示腫瘤浸潤記憶性 T 細胞可在局部識別腫瘤抗原進而發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。尤其是記憶性 T 細胞中的中樞型記憶性 T 細胞（central memory T cell，TCM）亞群可在體內(nèi)長期存活，并保持其抗原特異性[6]。因此，來源于腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中的記憶性 T 細胞，特別是 TCM有望為腫瘤抗原特異性 T 細胞提供更高效的篩選來源。

本實驗首先從肝癌患者腹水 TIL 中純化獲得含有 TCM成分的 CD8+CD62L+T 細胞。選擇 CD62L 為純化標(biāo)志的理由是：①CD62L 是初始 T 細胞和 TCM的共同標(biāo)記。經(jīng) CD62L 純化可排除已經(jīng)抗原刺激活化，但抗原特異性未知的活化 T 細胞和效應(yīng)型記憶性 T 細胞（effector memory T cell，TEM）[7]。②由于 TIL 細胞數(shù)量有限，并預(yù)先經(jīng)過了 CD8 磁珠分選。純化步驟過多將極大增加細胞損失數(shù)量，影響最終獲得抗原特異性 T 細胞的數(shù)量。在純化獲得 CD8+CD62L+T 細胞后，我們鑒定了其中的 TCM比例。隨后以肝癌相關(guān)抗原 AFP 九肽刺激 CD8+CD62L+T 細胞。以 CD137+T 細胞比例明確了抗原特異性 T 細胞活化程度后，最終通過磁珠純化獲得了針對 AFP 抗原肽的特異性 T 細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水樣本由東莞市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收集，患者簽署知情同意書。抽取HLA-A2+健康志愿者外周血樣本。

1.1.2 細胞株 人 TAP 缺陷 T2 細胞株為本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；人淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；重組人 IL-2、IL-15 為美國 R & D 公司產(chǎn)品；HLA-A2 限制性 AFP218-226表位 9 肽（LLNQHACAV）由杭州中肽生化有限公司合成；PC5 標(biāo)記抗人 CD8 抗體、FITC 標(biāo)記抗人 CD62L 抗體、PE 標(biāo)記抗人 CD44 抗體、ECD 標(biāo)記抗人 CD45RO 抗體、PE 標(biāo)記抗人 CD137 抗體均購自美國 BioLegend 公司；CD8 陰選磁珠試劑盒、CD62L 陽選磁珠試劑盒、CD137 陽選磁珠試劑盒均購自德國 Miltenyi 公司。

1.2 方法

1.2.1 腹水 TIL 分離 取新鮮抽取的 HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水樣本，與無菌生理鹽水按 1:1 的比例稀釋并混勻，加入淋巴細胞分離液，F(xiàn)icoll-Hapaque 密度梯度離心法分離單個核細胞。

1.2.2 人 PBMC 分離 抽取 HLA-A2+健康人靜脈血，F(xiàn)icoll-Hapaque 密度梯度離心法分離 PBMC。

1.2.3 CD8+T 細胞純化 腹水 TIL 及健康人 PBMC 分離當(dāng)天，以免疫磁珠法完成 CD8+T 細胞純化。根據(jù)試劑盒說明書完成操作。本步磁珠分離為陰選（雜細胞結(jié)合磁珠被吸附于分選柱，收集未結(jié)合磁珠而流出的 CD8+T 細胞）。

1.2.4 CD8+CD62L+T 細胞純化 以免疫磁珠法從 CD8+T 細胞中進一步純化 CD62L+T 細胞。根據(jù)試劑盒說明書完成操作。本步磁珠分離為陽選（雜細胞流出，洗脫并收集結(jié)合磁珠后被吸附于分選柱上的 CD62L+T 細胞）。最終獲得 CD8+CD62L+T 細胞。在添加 10% 胎牛血清、雙抗（青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml）的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分離后第 1 天，加入重組人 IL-2（50 IU/ ml）和重組人 IL-15（1 ng/ml）。每隔 3 天換液。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測 T 細胞表面標(biāo)志分子表達 PC5 標(biāo)記 CD8 抗體、FITC 標(biāo)記 CD62L 抗體、PE 標(biāo)記 CD44 抗體、ECD 標(biāo)記 CD45RO 抗體染色后上機。檢測 CD8+CD62L+T 細胞中以上 4 種分子表達陽性的細胞比例。

1.2.6 腫瘤相關(guān)抗原肽刺激 T 細胞 T2 細胞負載 HLA-A2 限制性 AFP218-226表位 9 肽（1 μmol/L）刺激活化分別來源于肝癌患者 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 細胞（數(shù)量為 5 × 106~ 1 × 107個，與 T2 細胞數(shù)量比例為 5:1）。在 T 細胞分離后于第 3 和第6 天進行兩輪刺激。

1.2.7 CD137+T 細胞檢測與純化 第 2 輪抗原肽刺激 24 h 后。PE 標(biāo)記 CD137 抗體染色，流式細胞術(shù)檢測分別來源于肝癌患者 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 細胞經(jīng)抗原刺激后 CD137+T 細胞比例，并以免疫磁珠法完成 CD137+T 細胞純化。

2 結(jié)果

2.1 CD8+CD62L+T 細胞純化

以 CD8 陰選磁珠從來自肝癌患者腹水 TIL 和健康人外周血 PBMC 中（各完成 3 個樣本）純化 CD8+T 細胞，純度均高于 95%。本步選擇陰選磁珠的目的是避免 CD8+T細胞與抗體包被磁珠結(jié)合，影響下一步 CD62L+T 細胞純化。獲得 CD8+T 細胞后，于當(dāng)日內(nèi)完成第二步 CD62L+陽選磁珠純化，獲得分別來自肝癌患者腹水 TIL 和健康人外周血 PBMC 的 CD8+CD62L+T 細胞，純度> 95%（圖 1）。

2.2 CD8+CD62L+T 細胞中 TCM亞群比例

通過 CD62L 磁珠純化，排除了 CD8+T 細胞中 CD62L 陰性表達的活化 T 細胞和 TEM。以 CD45RO 和 CD44 為表面標(biāo)記，實驗進一步檢測了 CD8+CD62L+T 細胞中 TCM（表型為 CD45RO+CD44high）及初始 T 細胞（CD45RO-CD44-）比例。如圖 2 結(jié)果所示，來源于肝癌患者腹水的 TIL 和健康人 PBMC 的CD8+CD62L+T 細胞都存在一定比例的 TCM。其中 TIL 來源 CD8+CD62L+T 細胞中的 TCM比例較高，但尚需要完成更多樣本的檢測以得出明確結(jié)論。

2.3 腫瘤相關(guān)抗原肽刺激后CD137+T細胞比例

以 TAP 缺陷性 T2 細胞株（僅遞呈外源性抗原肽）負載 AFP218-226表位 9 肽，刺激來源于肝癌患者腹水 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 細胞（各完成 3 例）。如圖 3 結(jié)果所示，抗原肽刺激后，腹水 TIL 來源 CD8+CD62L+T 細胞有較高的 CD137+T 細胞比例（介于 7% ~ 25%）（圖 3A ~ C）。與之相比，健康人 PBMC 來源 CD8+CD62L+T 細胞經(jīng)抗原刺激后 CD137+T 細胞比例較低（小于 4%）（圖 3D ~ F）。

2.4 CD137+T 細胞純化

以 CD137 磁珠對上述各 3 例經(jīng) AFP 抗原刺激的肝癌患者腹水 TIL 和健康人 PBMC 來源 CD8+CD62L+T 細胞完成純化。從其中兩例肝癌患者腹水 TIL 來源CD8+CD62L+T 細胞中純化獲得了 CD137+T 細胞，純度大于 95%（圖 4）。數(shù)量級約在 105。而健康人 PBMC 來源 CD8+CD62L+T 細胞由于比例較低，幾乎難以通過磁珠純化獲得 CD137+T 細胞。

A：TIL 中 CD8+T 細胞比例；B：磁珠純化后 CD8+T 細胞比例；C：CD8+T 細胞中 CD62L+ 細胞比例；D：磁珠純化后 CD62L+T 細胞比例

A ~ C：肝癌患者TIL 樣本1 ~ 3；D ~ F：健康人 PBMC 樣本 1 ~ 3

A ~ C：肝癌患者TIL 樣本 1 ~ 3；D ~ F：健康人 PBMC 樣本 1 ~ 3

A：肝癌患者 TIL 樣本 1；B：肝癌患者 TIL 樣本 2

3 討論

分離獲得可以高親和力與腫瘤抗原結(jié)合的特異性 CD8+T 細胞是提高腫瘤免疫治療效果的重要基礎(chǔ)[1]。然而由于外周血中的成熟 T 細胞在發(fā)育過程中經(jīng)歷了胸腺的陰性選擇，使能夠和腫瘤抗原（由于腫瘤免疫編輯，其成分接近正常組織細胞表達的分化抗原）高親和力結(jié)合的 T 細胞被清除[8]。因此從腫瘤患者體內(nèi)獲得足夠數(shù)量的抗原特異性 T 細胞難度較大。

研究者早就發(fā)現(xiàn)，與缺乏腫瘤抗原識別功能的外周血T 細胞不同，腫瘤局部浸潤的 TIL 提示了宿主對腫瘤的免疫反應(yīng)[9]。特別是 TIL 中的 CD8+T 細胞可能與腫瘤良好預(yù)后直接相關(guān)[10]。而關(guān)于腫瘤局部浸潤記憶性 T 細胞的研究更是為解決腫瘤抗原特異性T 細胞來源的問題提供了一條可能的思路。由于腫瘤局部浸潤高水平的 CD45RO+記憶性 T 細胞提示了更少的早期惡性侵襲標(biāo)志，更慢的病理進展進程和更長的生存期[5]。提示腫瘤患者體內(nèi)部分記憶性 T 細胞可在局部提供較長期的抗腫瘤免疫保護。通過選擇免疫功能相對較為確定的腫瘤浸潤記憶性 T 細胞作為篩選來源，可望有效提高腫瘤抗原特異性 T 細胞的篩選效率。

本實驗收集 HLA-A2 陽性 AFP 抗原表達陽性的肝癌患者腹水，從中分離出 TIL。隨后進行 CD8+及 CD62L+兩步磁珠純化，獲得 CD8+CD62L+T 細胞。完成磁珠純化后，以 CD45RO 和 CD44 為標(biāo)志分子[11]，實驗進一步檢測了 CD8+CD62L+T 細胞中初始 T 細胞和 TCM的亞群比例。結(jié)果證實，來源于腫瘤患者 TIL 的 CD8+CD62L+T 細胞存在著一定比例的 CD45RO+CD44highTCM。

實驗隨后以腫瘤相關(guān)抗原 AFP 抗原肽刺激了肝癌患者TIL 來源及健康人 PBMC 來源的CD8+CD62L+T細胞。以上抗原 9 肽已被證實可在體外有效刺激 T 細胞活化并產(chǎn)生 CTL 效應(yīng)（HLA-A2 限制性）[12]。結(jié)果顯示，肝癌患者TIL 來源CD8+CD62L+T 細胞經(jīng)抗原刺激后，可以觀察到較為明顯的CD8+CD137+細胞亞群。而健康人PBMC 來源 CD8+CD62L+T 細胞經(jīng)抗原刺激后 CD137+細胞比例較低。由于腫瘤患者初始 T 細胞難以有效識別腫瘤抗原，最終接觸腫瘤抗原肽刺激被有效活化的抗原特異性 T細胞可能主要來源于 CD8+CD62L+T 細胞中的 CD45RO+CD44highTCM。

以上結(jié)果提示，與正常人 PBMC 相比，腫瘤患者 TIL來源 CD8+CD62L+細胞中存在著可識別腫瘤抗原的 TCM，并在腫瘤抗原刺激后活化產(chǎn)生抗原特異性 T 細胞，從而在腫瘤局部提供有效的免疫保護。在腫瘤相關(guān)抗原肽刺激并明確 CD137+T 細胞活化比例后，實驗最終通過磁珠分選，從兩例肝癌患者 TIL 中純化獲得了一定數(shù)量可識別 AFP 抗原肽的 CD137+抗原特異性 T 細胞。通過本實驗所建立的方法，為進一步大量擴增抗原特異性 T 細胞，并通過分子生物學(xué)方法從抗原特異性 T 細胞中鑒定腫瘤抗原特異性 TCR 基因奠定了必要的實驗基礎(chǔ)。

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國家自然科學(xué)基金（31100664）；廣東省自然科學(xué)基金（10151022401000024）；東莞市科技計劃項目（2011105102027）

黃樹林，Email：shulhuang@sina.com

2014-05-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.012