張志來，陳建華

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定向進化技術(shù)在蛋白質(zhì)開發(fā)中的應(yīng)用進展

張志來，陳建華

210009 南京，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

定向進化技術(shù)是一種利用實驗室手段通過反復(fù)改造遺傳多樣性，結(jié)合文庫高通量篩選而獲得理想性狀生物體的過程，現(xiàn)已成為在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛和最有效的技術(shù)之一。目前已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究和開發(fā)。蛋白質(zhì)在生物催化、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。如何提高目的蛋白的產(chǎn)量、改善蛋白質(zhì)的理化特性以及構(gòu)建具有新催化活性的蛋白質(zhì)以滿足日益增長的需求是亟待解決的問題。而定向進化技術(shù)的發(fā)展為實現(xiàn)這樣的目的提供了強有力的技術(shù)支持。本文就定向進化技術(shù)在蛋白質(zhì)開發(fā)中的應(yīng)用進行了綜述。

1 定向進化技術(shù)

與理性突變方法相比，定向進化技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢：突變體的構(gòu)建無需受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的限制。早先的定向進化技術(shù)的靶標(biāo)多數(shù)是單個蛋白，通過隨機或定點插入突變，獲得穩(wěn)定性更好或催化活性更高的突變體以適應(yīng)工業(yè)化要求。而近年來的趨勢則轉(zhuǎn)向于對代謝途徑甚至是基因組水平進行改造，以創(chuàng)造新型全細胞催化劑用于合成有價值的生物產(chǎn)品[1]。

目前，比較經(jīng)典的定向進化技術(shù)有易錯 PCR 技術(shù)和 DNA 改組技術(shù)等，而新興的技術(shù)則是在這兩種技術(shù)的基礎(chǔ)上改進發(fā)展起來的。

1.1 易錯 PCR 技術(shù)

易錯 PCR 是利用 Taq DNA 聚合酶，或改變 PCR 反應(yīng)體系的條件，在 DNA 聚合過程中隨機引入錯配堿基，其突變位點發(fā)生在分子內(nèi)部，是應(yīng)用最早、最成熟的一種定向進化方法[2]。易錯 PCR 無需改變基因的長度，突變頻率可以根據(jù)反應(yīng)條件進行相應(yīng)的控制，并且能有效地獲得理想突變體，在蛋白質(zhì)定向進化中得到了廣泛的應(yīng)用。但是易錯 PCR 只能發(fā)生點突變，而且獲得活性突變體的效率比較低，因此其應(yīng)用受到了一定的限制。在易錯 PCR 基礎(chǔ)上，Gratz 和 Jose[3]發(fā)明了重疊延伸蛋白域文庫法（PDLGO），它克服了易錯 PCR 突變率低的缺陷，可以在預(yù)期的區(qū)域內(nèi)進行隨機突變。

1.2 DNA 改組

DNA 改組，又稱有性 PCR 技術(shù)，是由 Stemmer[4]于 1994 年首先提出，后經(jīng)不斷改進，現(xiàn)已成為比較完善的定向進化技術(shù)。它將單個基因或同源性較高的多個基因通過 DNase I 隨機片段化，藉由小片段之間的同源性，互為模板，互為引物重新組裝成大片段。然后，加入特異性引物進行有引物 PCR 擴增全長嵌合體基因，結(jié)合高通量篩選方法選擇具有功能改進或全新功能的突變體。目前，DNA 改組技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，是基因定向進化的最有效的方式，在蛋白生產(chǎn)和研究中是應(yīng)用最成功的技術(shù)之一[5]。

近年來，隨著對 DNA 改組的不斷完善和改進，新的依賴于同源重組的定向進化技術(shù)不斷涌現(xiàn)，如交叉延伸 PCR（StEP）技術(shù)[6]、隨機鏈交換法（RAISE）[7]、隨機引物體外重組（RPR）技術(shù)[8]、臨時模板隨機嵌合（RACHITT）技術(shù)[9]等（圖 1）。而基于同源重組的定向進化技術(shù)，需要待改造的基因具有一定的同源性，無法有效地在非同源性或同源性低的親本中應(yīng)用，同時文庫的多樣性往往無法達到理想的需求。因此，一些基于非同源重組實現(xiàn)隨機突變的技術(shù)應(yīng)運而生，如 SCRATCHY 文庫[10]、隨機多重 PCR[11]、外顯子改組[12]等。

ABC D

不斷更新的新技術(shù)致力于提高突變率，克服現(xiàn)有定向進化技術(shù)的限制因素。定向進化技術(shù)在生物醫(yī)藥、蛋白工業(yè)化生產(chǎn)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，單純的技術(shù)已不足以獲得理想的突變體，越來越多的研究則是趨向于結(jié)合多種技術(shù)對生物個體或是大分子進行改造，以期獲得理想的成果。

2 定向進化技術(shù)在蛋白質(zhì)開發(fā)中的應(yīng)用

近年來，由于工業(yè)化用酶及藥用蛋白的需求急劇增加，如何提高蛋白的產(chǎn)量、改善蛋白的特性以及構(gòu)建新功能蛋白以適應(yīng)日益增長的需求，是人們亟待解決的問題。定向進化技術(shù)的發(fā)展為實現(xiàn)這樣的目標(biāo)提供了基礎(chǔ)。

2.1 提高蛋白產(chǎn)量

2.1.1 目的蛋白過表達 啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式作用元件，位于基因上游，是由 RNA 聚合酶特異性識別的一段 DNA 序列。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，其強弱直接影響到外源基因表達的有效性，因此篩選強啟動子對于增強蛋白產(chǎn)量具有一定的促進作用。定向進化技術(shù)促進了高效啟動子的篩選。Alper 等[13]采用易錯 PCR 結(jié)合核苷酸類似物誘變的技術(shù)對 TEF1 啟動子進行改造獲得一個長度不同的啟動子突變體庫，從中篩選出不同特性的啟動子突變體以提高特定產(chǎn)物的表達量。

除了單純的對啟動子進行改造以外，提高啟動子結(jié)合蛋白，即 RNA 聚合酶的活性，對于增強目的基因的轉(zhuǎn)錄也具有重要的影響。Esvelt 等[14]采用 PACE（噬菌體輔助的持續(xù)進化）技術(shù)對啟動子結(jié)合蛋白 T7 聚合酶進行定向進化研究，經(jīng)過 200 輪的蛋白質(zhì)進化，獲得了一株比野生型 T7 RNA 聚合酶蛋白活性提高幾百倍的突變體，使得報告基因產(chǎn)物的產(chǎn)量提高了 100 倍。

對基因本身進行改造，使其更適于在相應(yīng)宿主內(nèi)表達，也是提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的一種方式。Egloff 等[15]采用易錯 PCR 技術(shù)，結(jié)合適當(dāng)?shù)倪x擇壓力對神經(jīng)降壓素（NTR1）進行改造，使得其在大腸桿菌內(nèi)的表達量提高，同時提高了蛋白的穩(wěn)定性。

2.1.2 蛋白質(zhì)生物合成途徑的調(diào)控 目前，細菌和酵母是蛋白外源表達最常用的宿主。通過在宿主中構(gòu)建或插入異源代謝途徑實現(xiàn)目的蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用前景。然而，異源途徑的代謝通量需要進行優(yōu)化以避免因過表達特定基因引起代謝負荷，同時還得避免因相關(guān)產(chǎn)物積累導(dǎo)致宿主細胞的生長抑制。平衡代謝通量的常用方法是確認代謝途徑的限速步驟，進而對限速酶進行修飾改造。最常用的解除瓶頸的方法是過表達代謝途徑中的關(guān)鍵基因、刪除競爭性途徑、利用定向進化技術(shù)提高限速酶的活性等[16]。

Dong 等[17]采用易錯 PCR 技術(shù)對 CpcA（藻青蛋白α 亞基）生物合成途徑中的限速酶進行了誘變，使得 CpcA 的產(chǎn)量比對照組提高了 29.7%。李曉萍等[18]為了解除代謝產(chǎn)物對芳香族氨基酸生物合成途徑中關(guān)鍵酶的反饋抑制作用，利用 DNA 改組技術(shù)對 aroG 基因進行改造，在一定程度上解除了氟苯丙氨酸對關(guān)鍵酶的抑制作用，從而使得目的產(chǎn)物得到積累。Gu 等[19]采用易錯 PCR 和定點突變技術(shù)對色氨酸代謝途徑中的啟動子和 trpE、aeoG 基因進行改造，同時對 L-色氨酸合成途徑中的弱化子和分支途徑進行敲除，最終使得改造菌株發(fā)酵 48 h 的 L-色氨酸產(chǎn)量達到 10.15 g/L。這些研究證實，對代謝通路中的酶進行改造可以作為蛋白質(zhì)合成和提高產(chǎn)量的有效策略。

近年來，越來越多的系統(tǒng)性誘變技術(shù)發(fā)展迅速。Wang 等[20]通過在大腸桿菌中反復(fù)進行單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的等位替換對基因組進行改造，發(fā)明了 MAGE（多重自動基因工程）技術(shù)。寡核苷酸含有簡并堿基，可以對靶基因引入插入或缺失突變，該研究對 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）途徑中的 24 個基因組分同時修飾，使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了 5 倍。而將這一技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高具有一定的實踐前景。

為了獲得理想的目的產(chǎn)物，有些研究則是按照自己的意愿構(gòu)建代謝途徑。而新代謝途徑的構(gòu)建費時費力，而且多重基因的同時調(diào)控往往成為其應(yīng)用瓶頸。Wingler 和 Cornish[21]則發(fā)明了一種快速構(gòu)建代謝途徑的迭代重組技術(shù)，該技術(shù)可以在進化過程中調(diào)整代謝途徑中所需基因的比例，從而獲得目的產(chǎn)物的高表達。因此人們可以運用這些技術(shù)按照自己的意愿高效、快速構(gòu)建蛋白合成途徑，從而提高蛋白的產(chǎn)量。

2.2 蛋白質(zhì)性質(zhì)的改良

為了適應(yīng)藥用蛋白及蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的要求，許多研究致力于通過定向進化技術(shù)獲得催化活性高、穩(wěn)定性好、蛋白質(zhì)相關(guān)性質(zhì)得到改善的突變體。目前定向進化技術(shù)已在提高酶的催化活性、穩(wěn)定性、底物特異性、選擇性等方面得到成功的應(yīng)用（表 1）。

2.3 修飾蛋白，賦予新的功能

目前，大部分定向進化的研究集中于對蛋白質(zhì)現(xiàn)有功能的改善，但是如何對天然蛋白質(zhì)進行改造以獲得新功能仍是研究的一大難題。蛋白質(zhì)新功能的產(chǎn)生往往需要對原始序列進行一系列突變、重組的大幅度改造，所得的突變體庫常含有大量的無活性蛋白，增加了篩選難度。

表 1 定向進化技術(shù)在改善蛋白質(zhì)性質(zhì)方面的應(yīng)用

定向進化技術(shù)的發(fā)展，為篩選和改造新功能的蛋白提供了契機。Li 等[34]通過人工設(shè)計并結(jié)合 DNA 改組技術(shù)對 IFN-α 進行改造，獲得了具有抗腫瘤活性的新型抗生素 Novaferon。Chao 等[35]則是采用計算機模擬結(jié)合定向進化技術(shù)在非催化活性支架蛋白的基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得了一種新型的 RNA 連接酶，該酶能將 5-三磷酸 RNA 連接到另一 RNA 的 3-羥基上，完成了自然界酶不能完成的反應(yīng)。Sabile 等[36]則以轉(zhuǎn)氨酶腳手架蛋白為基礎(chǔ)，結(jié)合點飽和誘變技術(shù)獲得了一種能夠催化合成手性胺的新型酶，提高了 II 型糖尿病治療藥物西他列汀的產(chǎn)量。

3 小結(jié)

運用定向進化技術(shù)獲得人們期望催化功能和活性的蛋白，對于加速蛋白工業(yè)化生產(chǎn)、蛋白藥物研發(fā)及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要的作用。除了上述幾個方面以外，定向進化技術(shù)在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、研究生物反應(yīng)機制、合成生物學(xué)等方面也具有廣泛的應(yīng)用。隨著科技產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們要求的提高，蛋白質(zhì)理性設(shè)計手段已難以滿足人們的實際需求。而現(xiàn)有的定向進化技術(shù)往往存在操作復(fù)雜、突變效率低等缺陷。因此，開發(fā)快捷、方便、高效的定向進化技術(shù)，對于蛋白質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用具有促進作用。

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陳建華，Email：jhchen@cpu.edu.cn.

2014-04-16

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.010