溫欣，張大為，郭順星，王春蘭

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螃蟹甲內生真菌sp.的化學成分研究

溫欣，張大為，郭順星，王春蘭

100193 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所分析中心

研究一株來源于藏藥螃蟹甲內生真菌 PHY-24 的化學成分。

采用麥麩培養(yǎng)基，對內生真菌 PHY-24 進行放大培養(yǎng)，通過硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、ODS 柱色譜、Sephadex LH-20 柱色譜、高效液相色譜等對其發(fā)酵液中的化學成分進行分離純化，利用 NMR、MS 等波譜方法進行化學成分的結構鑒定，并測定這些成分抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性。

從內生真菌 PHY-24 發(fā)酵液的乙酸乙酯提取部分分離并鑒定了 4 個化合物，分別是：integrastatin B（1）、2-乙?；?3,5-二羥基-苯乙酸（2）、curvulin（3）、O-methylcurvulinic acid（4）。其中化合物（1）和（2）具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性，其 IC50分別為 6.22 和 75.1 μmol/L。

4 個化合物均為從此屬真菌中首次分得，其中化合物（1）、（2）具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性?；衔铮?）的活性為首次報道。

內生真菌； 化學成分； 螃蟹甲

內生真菌是指那些在其生活史中某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括在其生活史中的某一階段營表生的腐生真菌和對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌[1]。盡管內生真菌廣泛存在于自然界中，但很長時間內沒有被重視。直到 1993 年，美國科學家 Stierle 等[2]從紅豆杉的內生真菌中分離得到了具有抗癌活性的紫杉醇，內生真菌代謝產物的重要性才逐漸被發(fā)掘。因存在于宿主植物內，內生真菌可以產生與宿主植物相同或相近的代謝產物，有時也能產生新的天然產物，成為天然產物的又一大資源庫[2-3]，而且內生真菌具有易培養(yǎng)、培養(yǎng)條件可控、產量較高的特點。國內外已有大量文獻報道了從植物內生真菌中分離得到多種活性化合物[4]。本科室從螃蟹甲中分離并鑒定了內生真菌 PHY-24（sp.），并測定其發(fā)酵產物具有良好的抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性[5]?；谏鲜霰尘?，本研究對其發(fā)酵產物化學成分進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 螃蟹甲內生真菌sp. 菌株由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所生物中心分離保藏，由本科室張大為鑒定。

1.1.2 儀器 Varian unity 600 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產品；AGZAB 2F 型質譜儀為英國 VG 公司產品；Waters 600 高效液相色譜儀、XBridge C18 分析型色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）、XBridge C18 制備色譜柱（18 mm × 150 mm，4 μm）為美國 Waters 公司產品；Phenomenex Synergi Hydro-RP C18 分析型色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、Phenemonex Hydro 制備色譜柱（21.20 mm × 250 mm，4 μm）為美國 Phenomenex公司產品；Pump Manager C-615 中壓色譜柱為瑞士 Buchi 公司產品。

1.1.3 試劑 分析純石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、丙酮購自北京化工廠；色譜純甲醇購自美國Burdick & Jackson 公司；薄層色譜硅膠板 GF254、柱色譜硅膠 H、300 ~ 400 目硅膠、200 ~ 300 目硅膠均購自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 購自美國Pharmacia 公司；核磁試劑（CDCl3、CD3OD、氘代試劑作為內標）購自美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 放大發(fā)酵 按照每升麥麩培養(yǎng)基含 30 g 麥麩、20 g葡萄糖、1.5 g MgSO4·7H2O、3 g KH2PO4的配方制備培養(yǎng)基。從平板 PDA 培養(yǎng)基上挑取 PHY-24 菌塊接種到裝有 150 ml 麥麩培養(yǎng)基的 250 ml 三角瓶中，采用搖床振蕩培養(yǎng) 2 ~ 3 d，搖床轉速控制在 120 r/min，培養(yǎng)溫度設定為 25 ℃。將培養(yǎng)好的 PHY-24 菌種液每瓶轉接至裝有 2.5 L 麥麩培養(yǎng)基的 5 L 三角瓶中，采用搖床振蕩培養(yǎng) 17 ~ 18 d，搖床轉速控制在 120 r/min，培養(yǎng)溫度設定為 25 ℃。每一批次的 PHY-24 放大發(fā)酵物為 10 L，共得發(fā)酵物 30 L。

1.2.2 提取分離 用尼龍布分離 PHY-24 發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液加入 1 倍體積乙酸乙酯，萃取濃縮得乙酸乙酯提取物 20 g。取10 g提取物采用硅膠柱色譜純化，以石油醚:乙酸乙酯（5:1），二氯甲烷:甲醇（10:1），甲醇進行梯度洗脫，共得14 流分。Fr8（0.8 g）經(jīng) Sephadex LH-20（甲醇）及制備HPLC（90% 甲醇-水，流速 8 ml/min）得化合物 1（31 mg）。另取 10 g 提取物采用 MCI 柱色譜純化，以甲醇-水不同比例梯度洗脫，共得 9 流分。Fr3（0.21 g）析出晶體，經(jīng)重結晶得化合物 2（27 mg）。Fr4（0.35 g）經(jīng) HPLC 制備（55% 甲醇-水，流速 10 ml/min）得化合物 3（22 mg）和化合物 4（34 mg）。

1.2.3 抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性測定 參照 He 等[6]建立的 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性檢測方法。反應在 96 孔透明微孔板中進行。用1 × 反應緩沖液（25 mmol/L 哌嗪-1,4-二乙磺酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、0.1 g/L BSA、5% 無菌甘油、20 mmol/L MnCl2）100 μl 洗板一次。加入 5 μl 用 DMSO 配制的待測樣品（陽性對照組為 50 mmol/L 的黃芩素，陰性對照組為溶劑 DMSO）至微孔板中，與整合酶在 2 × 反應緩沖液中 37 ℃溫育 20 min。加入 1.5 pmol/L 供體 DNA 和 15 pmol/L 靶 DNA 底物，混勻后 37 ℃反應 2 h。加入 1.5 μl 鏈霉親和素磁珠和 51.5 μl 結合緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，2 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.1%（w/v）吐溫 20]徹底振蕩混勻，20 ℃孵育15 min，每隔 5 分鐘振蕩混勻一次。將微孔板置于板式磁珠收集器靜置 90 s，棄上清液。用 100 μl TBST（含 0.1% Tween 20 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液）洗磁珠 3 次。加入100 μl 用 TBST 按照 1:5000 稀釋的堿性磷酸酶標記的地高辛抗體，振蕩混勻后于 37 ℃孵育 30 min。100 μl TBST 洗磁珠 3 次，將磁珠轉移到新的微孔板中。加入 100 μl 顯色底物緩沖液（6.7 mmol/L 對硝基苯磷酸二鈉、0.1 mol/L Na2CO3、2 mmol/L MgCl2，pH 9.5），避光顯色30 min。用酶標儀測定 405 nm 處的吸光值（405）。用以下公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并通過非線性擬合計算 IC50。

抑制率 =A陰性對照－A樣品× 100% A陰性對照－A陽性對照

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物 1：棕色粉末（TCM），ESI-MS m/z:403 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）δ：1.94（3H，s，H-19），2.20（3H，s，H-18），3.81（3H，s，H-21），3.82（3H，s，H-22），7.11（1H，s，H-7），7.21（1H，s，H-13），10.29（1H，s，H-20）。13C-NMR （CDCl3，600 MHz）δ：25.58（C-19），26.07（C-18），56.26（C-21），56.48（C-22），77.40（C-10），97.04（C-2），101.57（C-7），105.41（C-13），120.00（C-8），120.01（C-3），120.99（C-11），125.62（C-12），139.31（C-4），139.34（C-16），139.87（C-15），140.59（C-5），146.97（C-14），147.51（C-6），190.41（C-20），193.18（C-9）。與文獻[7]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為integrastatin B（圖 1A）。

化合物 2：白色粉末（MeOH），ESI-MS m/z:211 [M+H]+。1H-NMR（MeOH，600MHz）δ：6.27（1H，d，J = 2.4，H-8），6.21（1H，d，J = 2.4，H-6），3.65（2H，s，H-2），2.52（3H，s，H-2'）。13C-NMR（MeOH，600MHz）δ：206.15（C-1'），175.27（C-1），161.91（C-7），161.03（C-5），137.94（C-3），120.58（C-4），l12.03（C-8），102.71（C-6），40.79（C-2），32.38（C-2'）。與文獻[8-9]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為curvulin acid，即 2-乙?；?3,5-二羥基苯乙酸（圖 1B）。

圖 1 化合物 1（A）和 2（B）結構式

Figure 1 The molecular structures of compound 1 (A) and 2 (B)

化合物 3：無色片狀結晶（MeOH），ESI-MS m/z:239[M+H]+。參考文獻[9]鑒定為curvulin。

化合物 4：白色粉末（MeOH 或 DMSO），ESI-MS m/z:225[M+H]+。與文獻[9]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為 O-methylcurvulinic acid。

2.2 HIV-1 整合酶鏈轉移反應抑制劑篩選

采用高通量 ELISA 方法測定了化合物的抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性。結果表明，化合物 1、2 具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性，IC50分別為 6.22 和 75.1 μmol/L。其余 2 個化合物均無此活性。

3 討論

從藏藥螃蟹甲內生真菌 PHY-24 發(fā)酵產物乙酸乙酯提取物中分離得到 4 個化合物，均為sp. 中首次分得。這 4 個化合物文獻報道僅從微生物中得到[7-12]。到目前為止，integrastatin B 報道具有抗 HIV-1 整合酶活性，其 IC50為 2.5 μmol/L[7]；curvulin acid 未見任何活性報道；curvulin、O-methylcurvulinic acid 僅被報道為植物毒素，可致馬齒莧和多刺莧菜黑斑病[10]。

對上述化合物進行抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性篩選，結果顯示化合物 1 具有明顯的抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性，其 IC50為6.22 μmol/L，與文獻[7]報道基本一致；化合物 2 的抗 HIV-1 整合酶鏈轉移反應活性較微弱，其 IC50為 75.1 μmol/L，為本文首次報道。

目前，針對 PHY-24菌株活性代謝產物的研究仍在繼續(xù)，以期發(fā)現(xiàn)其他的活性成分。

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Chemical constituents of an endophytic fungussp. fromMukerjee

WEN Xin, ZHANG Da-wei, GUO Shun-xing, WANG Chun-lan

To study the chemical constituents of an endophytic fungus PHY-24 (sp.) from Tibetan medicinal plantsMukerjee.

PHY-24 culture was scaled-up using wheat bran medium. The chemical constituents from the fermentation broth of the strain PHY-24 were isolated and purified by silica gel, MCI, ODS and Sephadex LH-20 column chromatography, and their chemical structures were identified by analysis of MS and NMR. Bioactivities of the constituents were tested with anti-HIV-1 integrase strand transfer reaction.

Four compounds were separated and identified from the fermentation broth, including integrastatin B, curvulin acid, curvulin, O-methylcurvulinic acid. Integrastatin B and curvulin acid have anti-HIV-1 activity with IC50being 6.22 μmol/L and 75.1 μmol/L, respectively.

The four compounds were firstly obtained from thegenus, with integrastatin B and curvulin acid having anti-HIV-1 integrase strand transfer reaction activity. The activity of curvulin acid was firstly reported.

Endophytic fungus; Chemical constituents;Mukerjee

WANG Chun-lan, Email: wangchunlan2006@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.007

王春蘭，Email：wangchunlan2006@163.com

2014-04-17

Author Affiliation: Analysis Center, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China