北京北大維信生物科技有限公司（100094）馬威 王曉峰 孟春玲 張麗梅 閆夏

我公司QC微生物實驗室使用的黑曲霉孢子懸液主要用于基于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《藥典》）（2010年版一部）附錄XIII C“微生物限度檢查法”進行的微生物計數(shù)方法學驗證及計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查等，菌種是中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學保藏中心提供的冷凍干燥菌種“黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]”?！吨腥A人民共和國藥典》（2010年版 一部 ）附錄XIII C“微生物限度檢查法”中規(guī)定：“黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用”。為確定QC微生物實驗室制備的黑曲霉孢子懸液的貯存期，以保證QC微生物實驗室所用黑曲霉孢子懸液在貯存期內的質量符合要求，進行黑曲霉孢子懸液貯存期的確認。

1 風險分析

1.1 黑曲霉孢子懸液的質量可隨貯存而變差，其生長能力、生長狀態(tài)均可能變差而直接影響計數(shù)培養(yǎng)基的性能測試和質量控制、方法學驗證結果的準確性。為降低風險，應對黑曲霉孢子懸液制備后和貯存期內的菌落計數(shù)及菌落形態(tài)進行確認。

1.2 《藥典》規(guī)定工作菌種傳代次數(shù)至少為第3代且不得超過第5代，當菌種代次超過第5代時，可能會出現(xiàn)菌種變異，所以第5代菌種屬于“最差狀況”，選取第5代菌種進行貯存期確認。

附表1 黑曲霉孢子懸液貯存期確認用培養(yǎng)基、稀釋液

附表2 黑曲霉孢子懸液貯存期確認結果

2 實驗準備

確認用儀器、設備經國家計量檢測部門檢定合格，并在有效期之內。確認用試驗器具按規(guī)程清潔、滅菌后使用，且在有效期內。確認應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域進行，并為獨立的陽性潔凈區(qū)域。

3 確認用培養(yǎng)基、稀釋液

黑曲霉孢子懸液儲存期確認用培養(yǎng)基、稀釋液見附表1。

4 確認用菌種

4.1 菌種 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]，是由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學保藏中心提供的、保存于含有15%甘油的0.9%無菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷凍管傳代而得，以從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代。從0代傳代至第5代，制成黑曲霉斜面。

附圖 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]的菌落形態(tài)

4.2 工作菌種制備方法 用4.1中第5代黑曲霉斜面制備黑曲霉孢子懸液：取6支黑曲霉斜面，分別加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，振蕩60次，將孢子洗脫，過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內，即得[1]。

5 確認過程

5.1 “4.2”中孢子懸液制備的當日（第1天），將6支孢子懸液分別用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋法稀釋至10-7稀釋菌液。將每支孢子懸液的10-5、10-6、10-7稀釋菌液分別吸取1ml加入2個無菌平皿，分別注入15～20ml玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)3天，對其菌落數(shù)進行點計并觀察菌落形態(tài)。（稀釋菌液使用后立即傳出潔凈區(qū)，置于2～8℃冰箱中存放）[1]

5.2 選取“4.2”中每支孢子懸液制備的當日計數(shù)結果為50～100cfu/ml的稀釋菌液，即為考察用“含孢子數(shù)50～100cfu的黑曲霉孢子懸液”。將此懸液存放至第21天、第31天、第41天，分別吸取1ml加入2個無菌平皿，分別注入15～20ml玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)3天，對其菌落數(shù)進行點計并觀察菌落形態(tài)。（稀釋菌液使用后立即傳出潔凈區(qū)，置于2～8℃冰箱中存放）[1]

5.3 可接受標準

5.3.1 制備當日的黑曲霉孢子懸液，計數(shù)同時觀察菌落形態(tài)，菌落形態(tài)為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜質。菌落形態(tài)見附圖。

5.3.2 制備當日計數(shù)結果為50～100cfu/ml的稀釋菌液，在貯存期內計數(shù)結果不應有明顯變化，且在50～100cfu/ml范圍內；計數(shù)同時觀察菌落形態(tài)，菌落形態(tài)結果應與第一天菌液經培養(yǎng)后的形態(tài)相同，為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜質。菌落形態(tài)見附圖。

5.4 填寫原始記錄與貯存期的確定 儲存期為黑曲霉孢子稀釋菌液計數(shù)結果和菌落形態(tài)檢查結果同時符合5.3規(guī)定的考察期限（21天、31天、41天）中最長的減去1天。

6 結果

黑曲霉孢子懸液儲存期確定見附表2。

7 分析及結論

7.1 黑曲霉孢子懸液菌落形態(tài)：在黑曲霉孢子懸液制備后存放第21天、第31天、第41天培養(yǎng)后的菌落形態(tài)與黑曲霉孢子懸液制備當日的菌落形態(tài)相同，為：“黑褐色厚絨狀，色澤均一，無雜質。”

7.2 菌落計數(shù)比較：使用Minitab（版本號：16）進行雙樣本t檢驗，比較第21天、第31天、第41天培養(yǎng)后的菌落計數(shù)與第1天的差異，發(fā)現(xiàn)：第1天、第21天無明顯差異（無差異假設的P＝0.489）；第1天、第31天無明顯差異（無差異假設的P＝0.779），第1天、第41天有明顯差異（無差異假設的P＝0.027）。

7.3 黑-W-20101201-A2A1A1②A3A6的第21天、第31天菌落計數(shù)分別為42、44，低于下限50cfu/ml。但與第1天數(shù)值58差異較小，且t檢驗表明第1天、第21天、第31天總體無明顯差異，可認為是由微生物計數(shù)操作偶然造成。確認結果表明黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]孢子懸液制備后存放至第21天、31天時其各項質量控制項目均符合規(guī)定。在2～8℃冰箱存放，存放有效期可定為30天。