馬露，喬薪瑗，唐麗杰，姜艷平，崔文，李一經(jīng)

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

白介素-18 (Interleukin-18, IL-18)是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫調(diào)控中具有重要的作用。1995年日本學(xué)者Okamura等[1]從裸鼠的肝細(xì)胞中克隆到mIL-18基因，因其誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，最初被稱為IFN-γ誘生子，1996年被正式命名為IL-18[2-3]。IL-18主要由活化的巨噬細(xì)胞和 Kupfer細(xì)胞產(chǎn)生[4]，作為多效性細(xì)胞因子[5]，在促進(jìn) Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性方面具有重要作用，是一種特異性的Th1免疫反應(yīng)誘導(dǎo)因子[6-7]。許多研究表明，IL-18在增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病原微生物感染[8]、抑制病毒活性[2]等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，Ogawa等[9]利用豬紅斑丹毒絲菌表達(dá)了豬 IL-18，Shao等[10]利用真核系統(tǒng)表達(dá)了豬IL-18，并對(duì)其生物活性進(jìn)行研究，Chen等[11]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)豬 IL-18成熟蛋白進(jìn)行表達(dá)，抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果表明，豬IL-18對(duì)豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒及豬繁殖與呼吸綜合征病毒的增殖具有抑制作用。但上述系統(tǒng)表達(dá)的豬IL-18蛋白均需要純化與復(fù)性等過(guò)程，限制了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。

本研究通過(guò)乳酸乳球菌 p170系統(tǒng)表達(dá)pIL-18，該系統(tǒng)是由pH值和生長(zhǎng)期調(diào)控，不需要添加外源性的誘導(dǎo)物，并能高效提升蛋白分泌的水平[12-13]，外源蛋白通過(guò)分泌表達(dá)后，無(wú)需純化與復(fù)性等繁瑣的操作過(guò)程，拓寬了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。同時(shí)，通過(guò)對(duì)其生物活性的研究，為進(jìn)一步將其應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)劑和治療劑提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒 pAMJ399，乳酸乳球菌MG1363，大腸桿菌感受態(tài)TG1，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及相關(guān)試劑

限制性內(nèi)切酶BglⅡ、SalⅠ、DNA marker、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自百泰克；T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (10–230 kDa)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自NEB公司；HPR標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液 (TBD 原裝)，刀豆蛋白 A (ConA)，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Hyclone公司；TRIZOL Reagent RNA提取試劑購(gòu)自Introgen公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；pIL-18多抗為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

利用Primer基因分析軟件，參照GenBank上基因序列號(hào)為NM_213997.1的豬IL-18基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物P1、P2，并且在上下游引物 5′端分別加入 BglⅡ和 SalⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)注處為酶切位點(diǎn))。上游引物 P1：AGATCT-TACTTTGGCAAGCTTG；下游引物P2：GTCGAC-GAATATCTAGTTCTTGTTTTG。引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 豬淋巴細(xì)胞的分離與總RNA的提取

取豬脾臟，剪碎，用研磨器研碎，勻漿液經(jīng)200目銅網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)12 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，最后用適量PBS溶解，沿試管壁輕輕加在等體積淋巴細(xì)胞分離液面上，2 000 r/min離心10 min，小心收集中間的細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入另一試管中，加入0.5 mL PBS混勻，8 000 r/min離心1 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，棄上清，收集細(xì)胞，按照 TRIZOL Reagent說(shuō)明書提取總RNA。

1.2.3 豬IL-18基因的克隆

將提取的細(xì)胞總 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在 20 μL反應(yīng)體系中分別加入以下成分：模板RNA 12.5 μL，5×緩沖液 4 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNase抑制劑 0.5 μL，下游引物 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42 ℃孵育1 h。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)，擴(kuò)增體系 50 μL，其中 10×PCR緩沖液5 μL，上下游引物各 1.5 μL，dNTPs 4 μL，模板3 μL，ddH2O 35 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min，循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。用凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收產(chǎn)物與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為18Ts-pIL18，并送至博仕生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組乳酸乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建

將18Ts-pIL18重組質(zhì)粒和pAMJ399載體經(jīng)BglⅡ、SalⅠ雙酶切、膠回收，獲得帶有粘性末端的目的片段，16 ℃連接過(guò)夜，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，電轉(zhuǎn)電壓為2.0 kV，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于GM17 (含有紅霉素1 μg/mL)固體培養(yǎng)基，32 ℃厭氧培養(yǎng)20 h，挑取菌落接種于GM17 (含有紅霉素 1 μg/mL)液體培養(yǎng)基，32 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒鑒定。將獲得的重組乳酸乳球菌命名為pAMJ399-pIL-18/MG1363。

1.2.5 目的基因在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性重組菌 pAMJ399-pIL-18/MG1363單菌落接種于GM 17 (含有紅霉素1 μg/mL)液體培養(yǎng)基，32 ℃厭氧培養(yǎng)20 h，按1∶50的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 24 h后終止培養(yǎng)。上清通過(guò)TCA的方法進(jìn)行10倍濃縮，沉淀用溶菌酶處理，將處理好的上清和沉淀與2×SDS加樣緩沖液混合后煮沸10 min，經(jīng)12 000 r/min離心3 min，取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，并以同樣方法處理的pAMJ399/MG1363乳酸乳球菌作為對(duì)照。SDS-PAGE結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜 (NC)上，鼠源豬IL-18多克隆抗體(1∶500)作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 (1∶10 000)作為二抗，DAB顯色，觀察結(jié)果。

1.2.6 豬IL-18對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖作用

采用豬脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)對(duì)豬 IL-18的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌取 2周齡健康豬脾臟，用滅菌PBS洗滌2次，剪碎，經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，紅細(xì)胞裂解液處理后，稀釋計(jì)數(shù)，用完全1 640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至 1×106–5×106個(gè)/mL，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后加入0.1 mL終濃度分別為 3 mg/mL、1.5 mg/mL、750 μg/mL、375 μg/mL、180 μg/mL、90 μg/mL、45 μg/mL、23 μg/mL 的pIL-18，同時(shí)設(shè)陰性和空白對(duì)照組。將96孔板于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h，然后每孔加入 10 μL MTT (5.0 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL DMSO，混勻后振蕩3 min。以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定OD570值，并計(jì)算平均值。

1.2.7 豬IL-18抗病毒活性的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定 PrV、PEDV 在Vero細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染量 (TCID50)。

參考干擾素抗病毒活性測(cè)定方法，采用細(xì)胞病變抑制法[15]進(jìn)行抗病毒活性測(cè)定。將 Vero細(xì)胞接種于96孔板，待Vero細(xì)胞長(zhǎng)至單層后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 0.1 mL終濃度分別為 3 mg/mL、1.5 mg/mL、750 μg/mL、375 μg/mL、180 μg/mL、90 μg/mL、45 μg/mL、23 μg/mL 的 pIL-18，每一稀釋度接種6孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 5% ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)液，用維持液洗滌 1次，然后分別加入 100TCID50的 PEDV和 PrV各 100 μL繼續(xù)培養(yǎng)，未添加pIL-18組作為陰性對(duì)照，未接種病毒組作為空白對(duì)照。待對(duì)照組CPE達(dá)到75%時(shí)，經(jīng)倒置顯微鏡觀察結(jié)果并記錄。棄上清，每孔加入10 μL MTT (5.0 mg/mL)，培養(yǎng) 4 h 后，每孔加入 100 μL DMSO，混勻，振蕩3 min。以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定OD570值，并計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

重組菌 pAMJ399-pIL-18/MG1363經(jīng)SDS-PAGE分析后結(jié)果表明，重組菌的上清和沉淀經(jīng)電泳后，均出現(xiàn)了19 kDa的蛋白條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 pIL-18蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of porcine IL-18. M:protein molecular weight marker; 1: pAMJ399 vector transformed into MG1363 cells served as negative control; 2: MG1363 expressed recombinant pIL-18 protein in supernatant; 3: MG1363 expressed pIL-18 protein in precipitated.

2.2 Western blotting鑒定結(jié)果

重組菌pAMJ399-pIL-18/MG1363經(jīng)Western blotting檢測(cè)后結(jié)果表明，在重組菌上清和菌體沉淀的泳道均出現(xiàn)了19 kDa的特異蛋白反應(yīng)條帶，表明pIL18基因在乳酸乳球菌中獲得了分泌表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

2.3 豬脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，豬IL-18蛋白能明顯促進(jìn)豬脾淋巴細(xì)胞的增殖，當(dāng)?shù)鞍卓倽舛葹?75 μg/mL時(shí)，增殖效果最明顯 (差異極顯著**)，表明豬 IL-18蛋白具有良好的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 抗病毒活性的檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 PEDV和PrV的半數(shù)細(xì)胞感染量 (TCID50)的測(cè)定

按 Reed-Muench[16]法分別計(jì)算 PEDV 和PrV 的 TCID50，其 TCID50依次為 10–4/0.1 mL 和10–5/ 0.1 mL。

圖2 上清中pIL-18蛋白的Western blotting檢測(cè)Fig. 2 Western blotting analysis of pIL-18 protein in supernatant. M: protein molecular weight marker;1: MG1363 expressed pIL-18 protein in supernatant;2: pAMJ399 vector transformed into MG1363 cells served as negative control.

圖3 沉淀中pIL-18蛋白的Western blotting檢測(cè)Fig. 3 Western blotting analysis of pIL-18 protein in precipitated. M: protein molecular weight marker;1: MG1363 expressed pIL-18 protein in precipitated;2: pAMJ399 vector transformed into MG1363 cells served as negative control.

圖4 豬脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Result of lymphocyte’s proliferation with pIL-18 protein.

2.4.2 抗病毒活性的檢測(cè)結(jié)果

采用細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行抗病毒活性的檢測(cè)，結(jié)果表明，豬IL-18能有效抑制病毒復(fù)制，表現(xiàn)出良好的抗病毒活性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組相比，差異極顯著，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 MTT法檢測(cè)pIL-18蛋白的抗PrV活性Fig. 5 Anti-PrV activity of pIL-18 detected by MTT method.

圖6 MTT法檢測(cè)pIL-18蛋白的抗PEDV活性Fig. 6 Anti-PEDV activity of pIL-18 detected by MTT method.

3 討論

IL-18是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子，IL-18是由單核巨噬細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞等產(chǎn)生的一種具有多種免疫生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞及枯否氏細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性以及Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并可進(jìn)一步增強(qiáng)其抗病毒、抗腫瘤的功能[17-19]；同時(shí)可誘導(dǎo)某些細(xì)胞系MHC類分子的表達(dá)或抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，促進(jìn)細(xì)胞抗病毒及其他胞內(nèi)病原菌的感染[20-21]。因此，IL-18在抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、抗自身免疫性疾病及分子免疫佐劑作用等方面具有巨大的應(yīng)用潛力[22-23]。

有研究報(bào)道，pIL-18基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，但主要以包涵體形式存在[24]，需要對(duì)其進(jìn)行純化、復(fù)性才能應(yīng)用，且蛋白純化步驟復(fù)雜繁瑣，在純化過(guò)程中也會(huì)損失大量蛋白。本研究采用乳酸乳球菌分泌型表達(dá)載體pAMJ399，通過(guò)酸誘導(dǎo)啟動(dòng)P170啟動(dòng)子，將pH值調(diào)節(jié)到適宜的范圍即可自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)[25]，且表達(dá)蛋白能分泌到上清中，僅需簡(jiǎn)單離心即可獲得表達(dá)蛋白，省去了提取包涵體的繁瑣過(guò)程，減少了工作量，為應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)降低了成本。

通過(guò)豬脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和抗病毒活性的檢測(cè)，表明pIL-18能有效刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖，并能有效抑制病毒的增殖。同時(shí)，pIL-18自身具有無(wú)毒、高效、速效的佐劑特征，僅需微量即可發(fā)揮相應(yīng)的生物功能[26-27]，因此，pIL-18作為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，具有巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。本研究的開(kāi)展為其作為免疫調(diào)節(jié)劑的深入研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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