戴建軍，李翔，吳彩鳳，張樹(shù)山，張廷宇，張德福

1 上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106

2 上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106

睪丸注射是一種操作簡(jiǎn)便、成本低和適宜于大群生產(chǎn)的精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。1999年，Sato等[1]將外源基因注入小鼠睪丸，成功獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，并且轉(zhuǎn)基因可以穩(wěn)定遺傳到下一代，證實(shí)了睪丸注射可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此后睪丸注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取得較快發(fā)展，目前已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠[2-3]、兔[3]、豬[4]、綿羊[5]和雞[6-7]等動(dòng)物。但是睪丸注射法仍然存在不足，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因效率不穩(wěn)定、目的基因隨機(jī)插入、片段容易丟失和不能準(zhǔn)確表達(dá)等。

精子雖具有捕獲外源基因的能力，但效率相對(duì)較低，需利用一些試劑輔助以提高轉(zhuǎn)染效率。Kim等[8]首先在小鼠和豬睪丸注射中利用商業(yè)化的脂質(zhì)體，證實(shí)了其可以成功對(duì)動(dòng)物體內(nèi)生精細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。此后，研究者相繼發(fā)現(xiàn)了多種可以提高動(dòng)物生精細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染試劑，如 DMSO (二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide)和 DMN (2,6-萘二甲酸二甲酯，2,6-Naphthalenedicarboxylicacid)等，但是轉(zhuǎn)染效率仍不高，相關(guān)研究仍需深入進(jìn)行[3,9]。睪丸注射主要有睪丸網(wǎng)注射、曲精細(xì)管注射和間質(zhì)注射 3種方法。丁曉麟等利用睪丸網(wǎng)注射法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，63只仔鼠中有2只PCR鑒定呈陽(yáng)性[10]。Kanatsu -Shinohara等利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體注入未成熟小鼠曲精細(xì)管亦獲得轉(zhuǎn)基因仔鼠，平均效率為 2.8%[11]。Shen等使用DMSO處理外源DNA，通過(guò)睪丸間質(zhì)注射后收集小鼠精子后進(jìn)行體外授精，結(jié)果41.7%的胚胎表達(dá)綠色熒光；在兔睪丸進(jìn)行注射后，56.3%的仔兔 PCR鑒定呈陽(yáng)性[3]。孫敏等采用睪丸間質(zhì)注射的方法，成功獲得了轉(zhuǎn)基因雞，后代 PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為 27.27%[6]。然而，不同的睪丸注射方法所獲得的轉(zhuǎn)染效率差異很大，且不同文獻(xiàn)中所獲得的結(jié)果也不一致。

本研究擬從睪丸組織損傷和轉(zhuǎn)基因效率兩個(gè)方面，對(duì)3種轉(zhuǎn)染試劑 (兩種脂質(zhì)體LipofectamineTMLTX & PLUSTM和Lipofectamine 2000，一種納米化載體PAMAM-D)和3種睪丸注射方法 (睪丸網(wǎng)注射、曲精細(xì)管注射和睪丸間質(zhì)注射)進(jìn)行對(duì)比，旨在探索一種對(duì)小鼠睪丸損傷小、轉(zhuǎn)基因效率高的注射方法，為睪丸注射法在豬等大家畜中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6?7周齡昆明白小鼠由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；pEGFP-C1質(zhì)粒由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所易建中研究員惠贈(zèng)，該質(zhì)粒具有卡那霉素抗性，EGFP基因在細(xì)胞中由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)，大小4.7 kb；LipofectamineTMLTX & PLUSTM和 Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；納米化PAMAM-D購(gòu)自Qiagen公司；其余生化試劑均購(gòu)自Sigma公司；引物合成和測(cè)序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 轉(zhuǎn)染液制備

1) LipofectamineTMLTX & PLUSTM轉(zhuǎn)染液配制方法如下：在100 μL OPTI-MEM中按照順序加入 1 μL pEGFP-C1 質(zhì)粒 (1 μg/μL)，1.0 μL PLUS，輕輕混勻，靜置5 min，1.5 μL LTX，混勻，靜置30 min，注射前加入終濃度0.2%的臺(tái)盼藍(lán)為指示劑。

2) Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液配制方法如下：分別取兩管 50 μL OPTI-MEM，分別加入2 μL pEGFP-C1 質(zhì) 粒 (1 μg/μL)和 2 μL Lipofectamine 2000，室溫放置5 min將兩者溫和混勻，靜置30 min；注射前加入終濃度0.2%的臺(tái)盼藍(lán)為指示劑。

3) PAMAM-D轉(zhuǎn)染液配制方法如下：在100 μL OPTI-MEM 中加入 3 μL pEGFP-C1 質(zhì)粒(1 μg/μL)，混勻，3 μL PAMAM-D 混勻，短暫離心，室溫下靜置10?15 min，注射前加入終濃度0.2%的臺(tái)盼藍(lán)為指示劑。

1.3 睪丸注射

小鼠麻醉后進(jìn)行術(shù)部消毒，用眼科剪在小鼠下腹部?jī)蓚?cè)分別縱切0.8?1 cm切口，暴露睪丸和附睪，利用外徑60 μm顯微注射針和自制口吹注射管進(jìn)行注射。睪丸網(wǎng)注射方法如下：顯微鏡下找出睪丸血管蒂，其正下方0.2 mm的池狀結(jié)構(gòu)即是睪丸網(wǎng)，將顯微注射針平行進(jìn)針插入睪丸網(wǎng)腔內(nèi)進(jìn)行注射。曲精細(xì)管注射方法如下：顯微鏡下觀察睪丸內(nèi)曲精細(xì)管走向，順曲精細(xì)管方向?qū)@微注射針插入曲精細(xì)管內(nèi)進(jìn)行注射。睪丸間質(zhì)注射方法如下：取睪丸長(zhǎng)軸兩端為注射位點(diǎn)，避開(kāi)血管垂直進(jìn)行注射。

小鼠每側(cè)睪丸分別注入約為30 μL轉(zhuǎn)染液，當(dāng)大部分睪丸變成藍(lán)色時(shí)注射完成，兩側(cè)睪丸利用相同的方法注射。注射小鼠單籠飼養(yǎng) 30 d后，每組10只小鼠隨機(jī)選取5只與發(fā)情母鼠1∶2合籠，次日檢查陰道栓，見(jiàn)栓者單籠飼養(yǎng)，產(chǎn)仔后檢測(cè)仔鼠轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率和EGFP表達(dá)情況；每組剩余 5只小鼠解剖，附睪取精，計(jì)算精子總數(shù)、活力和精子EGFP陽(yáng)性率。

1.4 小鼠精子檢測(cè)睪丸注射

小鼠精子檢測(cè)方法如下：小鼠頸椎脫臼處死，打開(kāi)腹部，取出小鼠附睪尾部及輸精管，快速置于37 ℃，1 mL 預(yù)熱HTF培養(yǎng)液中，用針頭撕碎附睪和輸精管使精子游出，放入1.5 mL的 EP管中，37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育10 min，吸取上清液用于精子密度、活力和精子熒光檢測(cè)。

1) 精子密度與精子活力檢測(cè)：精子在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育10 min后，立即取10 μL精液于490 μL的HTF中等溫稀釋，采用精子全自動(dòng)分析儀檢測(cè)精子密度和精子活力。

2) 精子熒光檢測(cè)：取 10 μL精液于490 μL多聚甲醛中固定，混勻，取 10 μL含精子的多聚甲醛液體置于載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)EGFP陽(yáng)性精子比例。

1.5 仔鼠基因組提取及PCR檢測(cè)

按照 Axygen基因組 DNA提取試劑盒使用說(shuō)明，提取仔鼠尾尖基因組DNA。根據(jù)pEGFP-C1載體序列 (GenBank Accession No. U55763.1)，利用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5?-CCTGGTCGAGCTGGAAGGCGA-3?，下游引物：5?-ACGAACTCCAGCACCATG-3?。反應(yīng)長(zhǎng)度：528 bp，反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min ，1.5%凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的序列比對(duì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 19軟件包，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，采用單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)公鼠精子密度和活力的影響

采用睪丸網(wǎng)注射的方法對(duì) 3種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的精子總數(shù)和精子活力均有所降低，下降的程度由小到大依次為 LipofectamineTMLTX & PLUSTM、Lipofectamine 2000和PAMAM-D。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)精子轉(zhuǎn)染效率和仔鼠EGFP基因表達(dá)效率

睪丸網(wǎng)注射后，不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)轉(zhuǎn)基因效率的影響見(jiàn)表2、圖1和圖2。圖1為熒光下精子頭部綠色熒光表達(dá)，圖2為部分仔鼠PCR檢測(cè)結(jié)果。表1中LipofectamineTMLTX & PLUSTM組的陽(yáng)性精子率 (35.65%)和仔鼠PCR陽(yáng)性率 (29.17%)均要顯著高于其他兩組 (P<0.05)。部分仔鼠尾尖和腳趾在熒光下觀察可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá) (圖3)，其中LipofectamineTMLTX & PLUSTM組的EGFP表達(dá)率為 6.94%，Lipofectamine 2000組為 2.74%，PAMAM-D組為4.41%。

表1 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)公鼠精子密度和活力的影響 (n=15,x±s)Table 1 Effect of different transfection reagents on sperm density and motility of male mice (n=15,x±s)

圖1 EGFP陽(yáng)性表達(dá)精子 (200×)Fig. 1 Positive sperms with EGFP expression. (A)Sperm under visible light. (B)Sperm under fluorescent.

圖2 EGFP基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 The electrophoretogram of EGFP production amplified by PCR. 1?20: PCR production of newborn mice; M:DL2000 marker; P: plasmid; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 14, 16, 17 and 20 were PCR positive newborn mice.

表2 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)精子陽(yáng)性率和仔鼠EGFP基因表達(dá)率的影響 (n=15,x±s)Table 2 Effect of different transfection reagents on the rates of positive sperm and newborn EGFP expression(n=15,x±s)

圖3 EGFP轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性仔鼠 (40×)Fig. 3 EGFP positive newborn mice expressed EGPF. (A)Toes of newborn mice express green fluorescence under fluorescent. (B)Tail end of newborn mice express green fluorescence under fluorescent.

2.3 不同睪丸注射方法對(duì)公鼠精子密度和活力的影響

使用LipofectamineTMLTX & PLUSTM轉(zhuǎn)染試劑，3種不同睪丸注射方法處理的小鼠睪丸與正常小鼠睪丸相比較均發(fā)生萎縮，睪丸萎縮程度由小到大依次為睪丸網(wǎng)注射、曲精細(xì)管注射和睪丸間質(zhì)注射 (圖4)。不同睪丸方法注射后，3者的精子密度和精子活力均有所下降，其中曲精細(xì)管注射法和睪丸間質(zhì)注射法下降顯著 (P<0.05)，睪丸網(wǎng)注射法與對(duì)照組相比差異不顯著 (P>0.05)(表3)。

2.4 不同睪丸注射方法對(duì)精子轉(zhuǎn)染效率和仔鼠EGFP基因表達(dá)效率的影響

使用LipofectamineTMLTX & PLUSTM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行不同睪丸注射方法對(duì)精子轉(zhuǎn)染效率的比較。睪丸網(wǎng)注射后陽(yáng)性精子的比例為35.13%，顯著高于曲精細(xì)管組 (15.13%，P<0.05)。配種后兩組的仔鼠的 PCR陽(yáng)性率分別為30.77%和12.50%，差異顯著 (P<0.05)。仔鼠腳趾和尾尖經(jīng)熒光檢測(cè)，睪丸網(wǎng)注射法有4只小鼠呈綠色熒光表達(dá) (5.13%)，曲精細(xì)管注射有2只呈熒光表達(dá) (2.78%)。睪丸間質(zhì)注射法未能獲得EGFP陽(yáng)性精子，也未能獲得PCR陽(yáng)性和EGFP表達(dá)后代。

圖4 注射后小鼠睪丸形態(tài)Fig. 4. Mouse testicular morphology after injection.(A)Testes from rete testicular injection method. (B)Testes from seminiferous tubules injection method. (C)Testes from testicular interstitial injection method. (D)Testes from control with physiological saline.

表3 不同睪丸注射方法對(duì)公鼠精子密度和活力的影響 (n=15,x±s)Table 3 Effect of different testicular injection methods on sperm density and sperm of male mice (n=15,x±s)

表4 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)精子轉(zhuǎn)染效率和仔鼠EGFP基因表達(dá)效率 (n=15,x±s)Table 4 Effect of different testicular injection methods on the rates of positive sperm and newborn EGFP expression (n=15,x±s)

3 討論

睪丸注射法是一種簡(jiǎn)單、高效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法。睪丸注射法通過(guò)對(duì)雄性動(dòng)物睪丸內(nèi)生精細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，使生殖細(xì)胞攜帶外源基因，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)。Kim 等[12]最早研究證實(shí)，小鼠睪丸注射后精原干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)染外源基因。Li等[13]利用睪丸注射法獲得轉(zhuǎn)基因雞，并且對(duì)轉(zhuǎn)基因雞進(jìn)行了大群繁殖。但是睪丸注射法仍存在一些不足，如易造成對(duì)動(dòng)物的睪丸損傷、轉(zhuǎn)染效率較低和不能穩(wěn)定遺傳等問(wèn)題。本研究從不同轉(zhuǎn)染試劑和注射方法的角度系統(tǒng)探討睪丸注射對(duì)小鼠轉(zhuǎn)基因效率的影響因素。

轉(zhuǎn)染試劑的使用可以提高精子捕獲外源基因的能力。Kim 等[12]將脂質(zhì)體應(yīng)用到睪丸注射中，結(jié)果提高了小鼠和豬陽(yáng)性精子的比例，成功獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Celebi等[14]利用睪丸注射將DNA-脂質(zhì)體混合物注入小鼠睪丸，通過(guò)組織切片觀察到外源基因在未成熟的精子和不同階段生精細(xì)胞中均獲得表達(dá)。Amaral等[15]發(fā)現(xiàn)，DMSO也可增加精子捕獲外源基因的能力，提高睪丸注射后的轉(zhuǎn)基因效率。國(guó)內(nèi)陰彥輝等[16]結(jié)合小鼠的睪丸冰凍切片，經(jīng)熒光觀察和 PCR檢測(cè)，也證實(shí)外源基因經(jīng)過(guò)脂質(zhì)體包裹后可以在小鼠睪丸內(nèi)獲得表達(dá)，并可傳遞給下一代。然而不同的轉(zhuǎn)染試劑有著不同的轉(zhuǎn)染原理和效率，何種轉(zhuǎn)染試劑最適合在睪丸注射中進(jìn)行應(yīng)用的研究仍很少。Miao等利用 Lipofectamine 2000與Thanatin基因相混合進(jìn)行睪丸注射，結(jié)果獲得了38.46%的F1代仔鼠PCR陽(yáng)性率[17]。Yonezawa等[18]將8種商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑與DNA混合后注入小鼠睪丸中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染試劑自身特性影響轉(zhuǎn)基因效率，僅有兩種脂質(zhì)體獲得了相對(duì)較高的精子陽(yáng)性率。本研究選擇了 3種常用的轉(zhuǎn)染試劑在小鼠睪丸注射中進(jìn)行應(yīng)用，比較其轉(zhuǎn)染效率的差異，結(jié)果 LipofectamineTMLTX & PLUSTM組獲得的轉(zhuǎn)染效率最高。LipofectamineTMLTX & PLUSTM和Lipofectamine 2000屬于同一類轉(zhuǎn)染試劑，前者是在后者的基礎(chǔ)上改良而成，具有毒性小、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，本研究在小鼠的睪丸注射中也證實(shí)了這一點(diǎn)。PAMAM-D是一種納米化聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物，已經(jīng)在動(dòng)物和人類基因治療方面取得了良好的應(yīng)用，在精子孵育法建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中也有不錯(cuò)的表現(xiàn)[19-20]，但在睪丸注射中的應(yīng)用鮮有人報(bào)道。本研究表明 PAMAM-D可用于小鼠的睪丸注射，但轉(zhuǎn)染效率不如LipofectamineTMLTX & PLUSTM和Lipofectamine 2000，且細(xì)胞毒性較大。

除了常用的脂質(zhì)體法介導(dǎo)外源基因?qū)?，還有DMSO處理法[3]、慢病毒載體法[11]、電穿孔法[21]和直接外源基因注入法[22]等均可用于睪丸注射。這些方法各有利弊，實(shí)際使用中應(yīng)根據(jù)需求選擇合適的方法。

睪丸注射過(guò)程本身會(huì)對(duì)睪丸造成一定的機(jī)械損傷，加上轉(zhuǎn)染試劑的化學(xué)毒性，注射后動(dòng)物往往出現(xiàn)繁殖性能下降等問(wèn)題，因此選擇一個(gè)對(duì)睪丸損傷較小，轉(zhuǎn)染效率更高的睪丸注射方法尤為重要。Blanchard等[23]比較了睪丸網(wǎng)注射和睪丸間質(zhì)注射對(duì)大鼠生精細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，發(fā)現(xiàn)只有睪丸網(wǎng)注射可以成功轉(zhuǎn)染大鼠生精細(xì)胞。Park等[24]利用重組 EGFP基因桿狀病毒作為表達(dá)載體，對(duì)睪丸間質(zhì)注射和曲精細(xì)管注射兩者的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較，得出曲精細(xì)管更適宜對(duì)睪丸內(nèi)生精細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)論。由于桿狀病毒只能在節(jié)肢動(dòng)物中復(fù)制，因此其在脊椎動(dòng)物的應(yīng)用中具有較高的生物安全性。Kim等[25]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)，比較了曲精細(xì)管注射和睪丸間質(zhì)注射對(duì)EGFP基因表達(dá)的影響，結(jié)果獲得了與Park相似的結(jié)論。不同的報(bào)道有著不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這可能與每個(gè)實(shí)驗(yàn)有著不同的操作手法和使用不同的轉(zhuǎn)染試劑有關(guān)。本研究比較了睪丸網(wǎng)注射、曲精細(xì)管注射和睪丸間質(zhì)注射 3種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)效率的影響，結(jié)果睪丸網(wǎng)注射對(duì)小鼠睪丸損傷程度較小，且獲得的轉(zhuǎn)基因效率最高，睪丸間質(zhì)由于采用了多點(diǎn)注射的方法，對(duì)睪丸的損傷最大，未能獲得陽(yáng)性的精子和陽(yáng)性仔鼠后代。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)仔鼠的PCR陽(yáng)性率與精子的陽(yáng)性率比較相近，但成功表達(dá) EGFP基因的仔鼠比例卻不是很高，表明外源基因在隨后的受精和發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)生了丟失或缺失，影響了外源基因的表達(dá)，需進(jìn)一步對(duì)此種現(xiàn)象形成的機(jī)理進(jìn)行更深入研究。

本研究結(jié)果表明，采用 LipofectamineTMLTX & PLUSTM作為轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)合睪丸網(wǎng)注射可最大程度降低睪丸注射對(duì)小鼠睪丸的損傷，提高轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)效率。

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