江蘇省昆山市藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所（215300）狄蘇珍

江蘇省鹽城市藥品檢驗(yàn)所（224002）支榮榮△

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；BP 211D電子天平（德國Sartorius）；BT 224S電子天平（德國Sartorius）；Olympus bx51顯微成像系統(tǒng)。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)110742-2 0 0 516）；β-蛻皮甾酮對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1116 3 8-200603）；甲醇、乙腈（江蘇漢邦科技有限公司，色譜純）；水（二次重蒸餾水）等；其它試劑均為分析純。土牛膝樣品為10批次，購自江蘇各地。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 本品根橫切面木栓層數(shù)列細(xì)胞，皮層由十余列薄壁細(xì)胞構(gòu)成。異型維管束斷續(xù)排列成2～4輪，導(dǎo)管1至數(shù)個(gè)，中心木質(zhì)部集成2～3群，薄壁細(xì)胞內(nèi)含有眾多草酸鈣砂晶。見圖1。

2.1.2 薄層色譜鑒別[3]

取本品粉末1g，加乙醇2 0 ml，加熱回流40分鐘，濾過，取濾液10ml，加鹽酸1ml，加熱回流1小時(shí)后，濃縮至約5ml，加水10ml，用石油醚（60～90℃），20ml提取，提取液蒸干，殘?jiān)右掖?ml溶解，作為供試品溶液。另取齊墩果酸對(duì)照品，用乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010 年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇（40：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，于105 ℃ 烘約10分鐘。供試品溶液在與對(duì)照溶液相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

經(jīng)采用不同的溫濕度條件及不同薄層板（Merck硅膠G預(yù)制薄層板與青島海洋化工廠分廠產(chǎn)硅膠預(yù)制薄層板及自制薄層板）進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，該薄層條件重現(xiàn)性較好，層析的結(jié)果穩(wěn)定，其斑點(diǎn)清晰一致。色譜條件如正文。見附圖2。

附圖1 土牛膝根橫切面顯微特征圖

附圖2 土牛膝薄層色譜圖

附表 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2 浸出物[2]以正丁醇為溶劑，按照熱浸法，依法測(cè)定樣品10批，結(jié)果分別為11.2%、10.8%、10.9%、9.8%、9.9%、10.0%、10.0%、10.1%、12.5%、13.0%，最低測(cè)定值為9.8%，以最低測(cè)定值的80%設(shè)限，為7.8%，故建議規(guī)定本品醇溶性浸出物不得少于7.0%。

2.3 β-蛻皮甾酮的含量測(cè)定

FoamFatale TM研發(fā)人員指出如果采用美國消防協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)NFPA 11—2016 National Electrical Code中限定值的2～3倍的泡沫供給強(qiáng)度，可以大幅縮短滅火時(shí)間。FoamFatale TM系統(tǒng)設(shè)計(jì)的泡沫供給強(qiáng)度為20～30 L/(min·m2)。泡沫預(yù)制后儲(chǔ)存在高壓臥式罐中，設(shè)計(jì)分布式線性噴射口CLN(continuous linear nozzle)。探測(cè)火災(zāi)信號(hào)后，泡沫在管道內(nèi)完成膨脹，通過噴射口向罐體中心全輻射狀射出，泡沫在極短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散，在油品表面形成覆蓋層，隔絕氧氣，同時(shí)還具有冷卻罐壁的作用。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，用甲醇溶解成每1ml含0.1056mg的β-蛻皮甾酮的溶液（105.6μg/ml）。

2.3.2 供試品溶液的制備[4]取本品粉末（過三號(hào)篩）約lg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇30ml，密塞，浸泡過夜，超聲處理(功率300W，頻率40kHz) 30分鐘，濾過，用甲醇10ml分?jǐn)?shù)次洗滌容器及殘?jiān)?，合并濾液和洗液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Capcell C18 柱(4.6mm×150mm,5μm)；以乙腈-水-甲酸(16：84：0.1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為250nm。柱溫為30℃；流速為1.0ml/mlm；進(jìn)樣量均為10μl。在該色譜條件下，β-蛻皮甾酮可達(dá)到基線分離，其它成分對(duì)測(cè)定無干擾。顯示β-蛻皮甾酮對(duì)照品保留時(shí)間為18.245min；供試品中β-蛻皮甾酮保留時(shí)間為18.151min，保留時(shí)間一致，因?yàn)樗幉臒o法制備陰性對(duì)照，故未附陰性對(duì)照色譜圖。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液（105.6μg/ml）0.2ml 、0.5ml、1ml、2ml、4ml分別加入到10 ml的量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得對(duì)照品工作液系列。分別吸取10μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=1.001×104X-8.938，R2=0.9998；β-蛻皮甾酮在0.02112μg-0.4224μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（105.6μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.2%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，6，12，24，48h分別進(jìn)樣10μl，按上述條件測(cè)定峰面積，RSD為0.5%（n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品，按供試品溶液制備方法平行制備6份，依次測(cè)定，計(jì)算得β-蛻皮甾酮的含量，RSD為1.7%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（平均含量0.5426mg/g）0.5g，六份，分別精密吸取105.6μg/ml的對(duì)照品溶液3ml (即0.3168mg)，依法值得供試品溶液。分別吸取上述溶液各10μl測(cè)定回收率，結(jié)果見附表。

2.4.9 樣品測(cè)定及限度擬定 依2.4.2 方法測(cè)定10批樣品，結(jié)果按干燥品計(jì)算，含β-蛻皮甾酮分別為0.54mg/g，0.52 mg/g，0.51 mg/g，0.42 mg/g，0.41 mg/g，0.43 mg/g，0.57 mg/g，0.56 mg/g，0.47 mg/g，0.52 mg/g。最低測(cè)定值為0.41 mg/g，以最低測(cè)定值的80%設(shè)限，為0. 33%，故建議規(guī)定本品按干燥品計(jì)算，含β-蛻皮甾酮（C27H44O7）不得少于0.33mg/g。

3 討論

3.1 《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1989年版）中對(duì)土牛膝的維管束描述為“維管束續(xù)斷排列成3～6輪”，而現(xiàn)今多數(shù)權(quán)威資料描述為“異型維管束續(xù)斷排列成2～4輪”，實(shí)際情況也是“2～4輪”，可能與藥材多年來的變異有關(guān)，建議原標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)際情況修改。另外，“維管束”也應(yīng)改為“異型維管束”，因?yàn)榕Ｏサ木S管束屬于異常構(gòu)造（三生構(gòu)造），從概念上講，與正常的維管束是不同的。

3.2 近年來我們?cè)谛姓O(jiān)管過程中，發(fā)現(xiàn)中藥材及飲片存在著嚴(yán)重的摻假、摻雜現(xiàn)象，為此我們?cè)黾恿私鑫锏臋z查，以有效科學(xué)地評(píng)價(jià)其質(zhì)量。在浸出物檢查溶劑的選擇過程中，我們盡可能考慮用水作為溶劑，但實(shí)驗(yàn)表明用水提取后難以過濾，方法不可操作，可能是土牛膝中含有大量的皂苷類成分和糖類成分所致，考慮到土牛膝含有主要成分為皂苷類，所以最終采取了正丁醇為溶劑。

3.3 在本課題研究之初，我們對(duì)土牛膝的基原進(jìn)行了嚴(yán)格的鑒定，土牛膝為莧科植物牛膝的野生品，而現(xiàn)在市場(chǎng)上主要為栽培品。目前市場(chǎng)上是懷牛膝和川牛膝，懷牛膝即為牛膝，主產(chǎn)河南，為四大懷藥之一，而川牛膝與牛膝植物來源不同，為另一品種，在臨床使用上應(yīng)該嚴(yán)格區(qū)分。本文沒有對(duì)栽培的牛膝和野生的土牛膝的含量進(jìn)行比較，今后可以作為課題進(jìn)一步研究。