摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病，不僅降低蔬菜的產(chǎn)量，還影響蔬菜的品質(zhì)?；卺劸平湍钢?個典型14-3-3蛋白質(zhì)序列，利用Blastp以及關(guān)鍵詞對炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，明確該菌存在2個典型的14-3-3蛋白質(zhì)，分別命名為ChFTT1、ChFTT2；對這兩個蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域以及亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，可為深入研究希金斯炭疽菌14-3-3蛋白質(zhì)功能提供參考。

關(guān)鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；14-3-3蛋白質(zhì)；信號肽；二級結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位

中圖分類號：S435.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3669-04

Bioinformatics Analysis of 14-3-3 Protein in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and

Control of Yunnan Province， Kunming 650224， China）

Abstract： Colletotrichum higginsianum Sacc. can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， reduce the production of vegetables and affect the quality of vegetables. Based on two typical 14-3-3 protein sequences in Saccharomyces cerevisiae， 14-3-3 related protein sequence was searched from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp. Two typical ones named as ChFTT1 and ChFTT2 were identified in C. higginsianum Sacc. Bioinformatics analysis of 14-3-3 proteins including physicochemical properties， the secondary structure， hydrophobic， the signal peptide， trans-membrane domain structure and sub-cellular localization were made. This study will play theoretical foundation for studying the function of 14-3-3 protein in C. higginsianum Sacc.

Key words： Colletotrichum higginsianum Sacc.； 14-3-3 protein； signal peptide； secondary structure； sub-cellular localization

收稿日期：2013-11-20

基金項(xiàng)目：云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（ZK11A101；ZK11SB01）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014Y330）

作者簡介：韓長志（1981-），男，河北石家莊人，講師，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)研究，（電話）15877923075（電子信箱）

hanchangzhi@gmail.com。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜、小油菜、大白菜以及羽衣甘藍(lán)等多種十字花科蔬菜，引起炭疽病，是一類重要的世界性植物病害[1-3]。在我國，菜心炭疽病是菜心上最常見和發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一，該菌也成為限制菜心產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因子[4]。14-3-3蛋白質(zhì)是由Moore等[5]于1967年首次從牛腦組織中分離得到的一種酸性可溶性蛋白質(zhì)，其作為結(jié)合蛋白質(zhì)廣泛存在于擬南芥、水稻、番茄等真核生物中[6]。在植物中，該蛋白質(zhì)可參與赤霉素、脫落酸、油菜素類固醇化合物以及乙烯等植物激素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK、營養(yǎng)代謝調(diào)控和光信號應(yīng)答等過程[7，8]。此外，該蛋白質(zhì)還參與植物對滲透脅迫[9]、病原脅迫[10]等多種脅迫的應(yīng)答。

目前，學(xué)術(shù)界對希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白質(zhì)的研究尚未見報道。因此，本研究基于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在的2個典型14-3-3蛋白質(zhì)（Bmh1、Bmh2）序列[11]，通過對炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Blastp比對及關(guān)鍵詞搜索，以期明確希金斯炭疽菌中14-3-3蛋白質(zhì)的分布情況，同時，通過生物信息學(xué)分析，研究14-3-3蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、疏水性以及亞細(xì)胞定位情況、二級結(jié)構(gòu)特征等，為進(jìn)一步深入開展該蛋白的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)釀酒酵母S288c中Bmh1、Bmh2氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html）進(jìn)行在線Blastp比對[12]，E-value選擇1e-50，其他參數(shù)均選擇默認(rèn)值，獲得希金斯炭疽菌中所含有的候選14-3-3蛋白質(zhì)，同時，通過輸入“14-3-3”，在上述數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索；另外，利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）明確該菌中14-3-3蛋白質(zhì)登錄號的信息。endprint

1.2 方法[13]

1.2.1 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用SMART網(wǎng)站在線分析希金斯炭疽菌中14-3-3所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。

1.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測 利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線進(jìn)行分析，預(yù)測14-3-3的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量及氨基酸組成等理化性質(zhì)。

1.2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 采用PHD（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在線分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測 利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）在線分析蛋白質(zhì)的疏水性。

1.2.5 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號肽預(yù)測 利用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線分析預(yù)測蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽。同時，利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）在線分析預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽，該網(wǎng)站提供兩種計算蛋白質(zhì)信號肽的算法，一種是隱馬可夫模型（Hidden markov models， HMM），另一種是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法（Neural Networks， NN）。對上述兩種方法所預(yù)測的蛋白質(zhì)信號肽結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線分析預(yù)測跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 亞細(xì)胞定位分析 利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在線進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯炭疽菌含有2個典型的14-3-3蛋白質(zhì)

在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，利用Blastp比對分析以及關(guān)鍵詞搜索，發(fā)現(xiàn)希金斯炭疽菌中存在2個候選的14-3-3蛋白質(zhì)，其ID為CH063_00205.1、CH063_11444.1（表1）。經(jīng)過SMART分析結(jié)果（圖1）表明，這兩個序列均含有保守的14-3-3結(jié)構(gòu)域，因此，根據(jù)其氨基酸大小以及英文縮寫（14-3-3， Fourteen-Three-Three），將其分別命名為ChFTT2和ChFTT1。

2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

希金斯炭疽菌中2個14-3-3的氨基酸數(shù)量差別不大，其相對分子質(zhì)量、分子式以及原子數(shù)量也相差不多（表2）。ChFTT1、ChFTT2的理論等電點(diǎn)分別為4.81、4.77，均屬于酸性氨基酸，上述蛋白質(zhì)的半衰期較為一致，均為30 h。盡管2個14-3-3蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)有一定的差別，但其均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。另外，上述兩個14-3-3蛋白質(zhì)的親水性均為負(fù)值。表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均屬于親水性蛋白質(zhì)。

2.3 蛋白質(zhì)疏水性分析

利用Protscale程序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，希金斯炭疽菌中存在的2個14-3-3蛋白質(zhì)疏水性情況不同，ChFTT1中位于257位的甘氨酸（E），其親水性最強(qiáng)，為-2.432，而位于175位的亮氨酸（S），其親水性最弱（疏水性最強(qiáng)，下同），為0.853；ChFTT2中位于121位的蛋氨酸（H），其親水性最強(qiáng)，為 -1.626，而位于177位的丙氨酸（S），其親水性最弱，為0.989（圖2）；ChFTT1、ChFTT2親水性氨基酸殘基數(shù)值總和分別為-160.308、-137.117，其疏水性氨基酸殘基總和分別為10.984、17.489。希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質(zhì)的疏水性有所差異，但均為親水性蛋白質(zhì)，這與通過理化性質(zhì)分析得到的總平均親水性GRAVY（Grand average of hydropathicity）結(jié)果一致。

2.4 轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號肽特征

通過分析（表3）表明，希金斯炭疽菌中的ChFTT1、ChFTT2均可以定位在細(xì)胞質(zhì)中，其中，ChFTT1在分泌途徑信號肽的預(yù)測值為0.924，其概率大于0.8，在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體目標(biāo)肽的預(yù)測值分別為0.059、0.090；ChFTT2在分泌途徑信號肽的預(yù)測值為0.907，其概率大于0.8，在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體目標(biāo)肽的預(yù)測值分別為0.072、0.107。

經(jīng)過SingnalP 3.0分析，ChFTT1、ChFTT2經(jīng)NN和HMM預(yù)測均不具有信號肽序列。

2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將希金斯炭疽菌的2個14-3-3蛋白質(zhì)氨基酸序列分別輸入PHD蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站獲得其二級結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果表明，2個14-3-3蛋白質(zhì)均含有α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲，均不含有β轉(zhuǎn)角，其中α螺旋結(jié)構(gòu)所占比例較高（圖3、圖4）。

2.6 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過TMHMM在線分析，并未發(fā)現(xiàn)希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質(zhì)含有典型的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，這與通過SMART在線分析所獲得的結(jié)果一致。

2.7 亞細(xì)胞定位分析

目前，研究者對植物中14-3-3蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，不同物種的蛋白質(zhì)定位不同，主要集中在細(xì)胞核[14]、細(xì)胞質(zhì)[15]、膜或其他細(xì)胞腔隙中[16]等。通過TMHMM在線分析發(fā)現(xiàn)，希金斯炭疽菌中2個14-3-3蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況相同，均定位于細(xì)胞質(zhì)中（表4），在細(xì)胞核、胞外、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體中均無定位，這與對禾谷炭疽菌14-3-3蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位情況一致（待發(fā)表）。endprint

3 結(jié)論與討論

目前，希金斯炭疽菌全基因組序列已經(jīng)公布，對深入解析其致病相關(guān)因子，針對上述致病因子為作用靶標(biāo)的防治藥劑開發(fā)具有重要意義。目前，對植物中的14-3-3蛋白質(zhì)的功能研究較多，而關(guān)于真菌中該蛋白質(zhì)的研究較為少見。因此，本研究通過利用釀酒酵母中已經(jīng)報道的2個14-3-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對，以及通過搜索關(guān)鍵詞等方法，獲得希金斯炭疽菌中2個典型的14-3-3蛋白質(zhì)氨基酸序列?；谏鲜霭被嵝蛄校蒙镄畔W(xué)分析網(wǎng)站對其理化性質(zhì)、信號肽情況以及跨膜區(qū)等進(jìn)行分析，初步明確了該蛋白質(zhì)所具有的理化特性、亞細(xì)胞定位情況，為今后開展該菌蛋白質(zhì)的功能研究提供了理論參考。

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3 結(jié)論與討論

目前，希金斯炭疽菌全基因組序列已經(jīng)公布，對深入解析其致病相關(guān)因子，針對上述致病因子為作用靶標(biāo)的防治藥劑開發(fā)具有重要意義。目前，對植物中的14-3-3蛋白質(zhì)的功能研究較多，而關(guān)于真菌中該蛋白質(zhì)的研究較為少見。因此，本研究通過利用釀酒酵母中已經(jīng)報道的2個14-3-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對，以及通過搜索關(guān)鍵詞等方法，獲得希金斯炭疽菌中2個典型的14-3-3蛋白質(zhì)氨基酸序列?；谏鲜霭被嵝蛄?，利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站對其理化性質(zhì)、信號肽情況以及跨膜區(qū)等進(jìn)行分析，初步明確了該蛋白質(zhì)所具有的理化特性、亞細(xì)胞定位情況，為今后開展該菌蛋白質(zhì)的功能研究提供了理論參考。

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3 結(jié)論與討論

目前，希金斯炭疽菌全基因組序列已經(jīng)公布，對深入解析其致病相關(guān)因子，針對上述致病因子為作用靶標(biāo)的防治藥劑開發(fā)具有重要意義。目前，對植物中的14-3-3蛋白質(zhì)的功能研究較多，而關(guān)于真菌中該蛋白質(zhì)的研究較為少見。因此，本研究通過利用釀酒酵母中已經(jīng)報道的2個14-3-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列（Bmh1、Bmh2），在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對，以及通過搜索關(guān)鍵詞等方法，獲得希金斯炭疽菌中2個典型的14-3-3蛋白質(zhì)氨基酸序列。基于上述氨基酸序列，利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站對其理化性質(zhì)、信號肽情況以及跨膜區(qū)等進(jìn)行分析，初步明確了該蛋白質(zhì)所具有的理化特性、亞細(xì)胞定位情況，為今后開展該菌蛋白質(zhì)的功能研究提供了理論參考。

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