彭利靜，李慧，李超民

解放軍第451醫(yī)院 心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054

動脈鈣化是指鈣鹽沉積在動脈壁組織的一種病理改變。人體內(nèi)的鈣主要以羥基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齒中，當動脈鈣化發(fā)生時，鈣會以磷酸鈣的形式沉積在脈管系統(tǒng)，導致動脈鈣化的發(fā)生。沉積在脈管系統(tǒng)的磷酸鈣會減少主動脈和支動脈的彈回率，從而改變心血管系統(tǒng)的血液流動力學，導致高血壓、主動脈瓣狹窄、心臟肥厚、心肌和下肢缺血、充血性心力衰竭，因此導致死亡率上升[1-3]。這種鈣化可以發(fā)生在不同部位（心臟瓣膜、動脈內(nèi)膜和中膜、毛細血管等），可呈局部、集中或彌散的鈣化，由此導致的損傷會引起急性炎癥和鈣代謝的平衡失調(diào)[4]。

鈣化多發(fā)生于老年人中，隨著生活水平的提高，血管疾病發(fā)生率呈上升趨勢，而發(fā)病年齡呈年青化趨勢，其中血管鈣化較普遍。許多疾病早期都發(fā)生炎癥反應，炎癥反應在鈣化發(fā)生過程中同樣起著重要的作用。我們以大鼠動脈鈣化為模型，研究了鈣化發(fā)生過程中NALP3炎癥小體復合物分子的變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料

4周齡SD大鼠，體質(zhì)量150 g左右，訂購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；卵磷脂購自北京化學試劑公司；豬源膽酸購自國藥集團；β-磷酸甘油酯購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；TRIzol購自天根公司；引物由北京奧科公司合成。

1.2 維生素D3注射液的配制

溶液A：0.6 g卵磷脂溶于260 μL無水酒精，制成卵磷脂溶液；25.5 mg VD3溶于卵磷脂溶液，加入0.75 g玉米油，充分振蕩溶解。溶液B：26 mg膽酸溶于7.3 mL生理鹽水。將溶液A溶于溶液B中，在振蕩器上充分振蕩，所得溶液為乳濁注射液。

1.3 大鼠動物模型的建立

SD大鼠42只分為對照組和鈣化組，對照組6只，鈣化組36只。鈣化組按時間梯度（0.5、1、3、7、14、28 d）分為6組，每組6只。鈣化組給予VD3注射液，劑量為30萬U/（kg·d），連續(xù)注射14 d，每天同一時間皮下注射。在不同時間點收取鈣化大鼠，取其主動脈，放入無RNAase的離心管中，凍存于-80℃。

1.4 HE染色

將制好的石蠟切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脫蠟10 min，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，用1%的鹽酸乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗2 min，伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗5 min，梯度乙醇溶液（50%、70%、80%、95%）脫水，晾干后用中性樹膠封片。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取大鼠動脈組織，加入1 mL TRIzol裂解，用玻璃棒研磨，用氯仿和異丙醇抽提總RNA，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀物，DEPC水溶解RNA，-80℃保存。取 2 μg總 RNA，在含 1.5 μL oligo（dT）、5 μL dNTP混合液、1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.625 μL核糖核酸酶抑制劑、5 μL M-MLV緩沖液的20 μL體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別進行PCR擴增基因。引物為Rat nalp3-上游（5'GACCAGGAGGTTGTTCAGATCTTC3'）、Rat nalp3-下 游（5'TCCATTCTGGTAGAGAGGTTGATC 3'）、Rat ASC-上游（5'ACCACACCCTTGCACAGCC TATC3'）、Rat ASC-下游（5'CACATTGCCATACAG AGCATCCAG3'）、Rat Caspase-1-上游（5'GTGAGT GTAGGGACAATAAATGGA3'）、Rat Caspase-1- 下游（5'CTAAAGGGCAAAACTTGAGGGAAC3'）、Rat β-actin-上游（5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3'）、β-actin-下游（5'CCCATACCCACCATCACACC3'）。PCR反應體系為20 μL，擴增條件為95℃預變性5 min、95℃變性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動脈鈣化模型的建立

我們以SD大鼠作為實驗對象制備動物鈣化模型，取其主動脈血管制備石蠟切片，HE染色顯示主動脈中膜和內(nèi)膜鈣化情況，見圖1。未給予VD3組大鼠主動脈中膜和內(nèi)膜完整，給予VD3組大鼠主動脈中膜和內(nèi)膜因發(fā)生鈣化而斷裂。

2.2 NALP3炎癥小體相關基因在鈣化模型中被激活

我們進一步確定NALP3炎癥小體在體內(nèi)鈣化模型中的情況。4周齡SD大鼠按不同時間點（0、0.5、1、3、7、14、28 d）皮下注射VD3，對照組注射除VD3外的溶劑，于不同時間點處理大鼠。提取大鼠的主動脈總RNA，RT-PCR檢測NALP3炎癥小體基因的表達差異。結(jié)果如圖2所示，以β-actin為內(nèi)參，在0.5 d時NALP3炎癥小體基因（NALP3、ASC、Cas?pase-1）轉(zhuǎn)錄水平開始上升，并持續(xù)上升至鈣化誘導第7 d，在鈣化后期（14、28 d）轉(zhuǎn)錄水平下降，這表明NALP3炎癥小體在動物鈣化早期被激活。

圖1 大鼠鈣化模型的建立

圖2 NALP3炎癥小體在體內(nèi)鈣化模型中被激活

3 討論

文獻報道的大鼠動脈鈣化模型的制作方法主要有維生素D3加尼古丁法[5]、維生素D3加華法令法[6]和單用維生素D3法[7]。研究表明[8]，維生素D3能顯著促進動脈鈣化的發(fā)生。經(jīng)皮下注射維生素D3后，血鈣濃度顯著升高，并破壞動脈管壁的完整性，但具體機制不明確。本實驗采用單用維生素D3法，皮下注射給予實驗組大鼠大劑量VD3，制作了大鼠動脈鈣化模型，經(jīng)病理（HE染色）證實模型制作成功，可見動脈中膜彈力層和內(nèi)膜大量被破壞，由于制片過程中有部分鈣鹽脫落，造成中層有空白形成。

炎癥小體是一種胞內(nèi)模式識別受體復合物，主要應答進入胞內(nèi)的病原相關分子模式（pathogen-as?sociated molecular pattern，PAMP），通過分泌IL-1β參與宿主先天性免疫反應。研究表明，一些晶體結(jié)構(gòu)物和外來蛋白聚集體可以激活NALP3信號通路，如尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）和引起自發(fā)炎癥痛風和關節(jié)炎的焦磷酸鈣脫水化合物（calcium pyrophosphate dehydrate，CPPD）都能激活NALP3炎癥小體[9]。我們的實驗表明，大鼠動脈鈣化誘導過程中 NALP3、ASC、Caspase-1的轉(zhuǎn)錄水平升高，表明NALP3炎癥小體的相關基因在鈣化模型中被激活。這些發(fā)現(xiàn)為我們進一步研究動脈鈣化的機制及篩選抗動脈硬化藥物打下了基礎。

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