彭利靜，李慧，李超民

解放軍第451醫(yī)院 心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054

動(dòng)脈鈣化是指鈣鹽沉積在動(dòng)脈壁組織的一種病理改變。人體內(nèi)的鈣主要以羥基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齒中，當(dāng)動(dòng)脈鈣化發(fā)生時(shí)，鈣會(huì)以磷酸鈣的形式沉積在脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致動(dòng)脈鈣化的發(fā)生。沉積在脈管系統(tǒng)的磷酸鈣會(huì)減少主動(dòng)脈和支動(dòng)脈的彈回率，從而改變心血管系統(tǒng)的血液流動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄、心臟肥厚、心肌和下肢缺血、充血性心力衰竭，因此導(dǎo)致死亡率上升[1-3]。這種鈣化可以發(fā)生在不同部位（心臟瓣膜、動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜、毛細(xì)血管等），可呈局部、集中或彌散的鈣化，由此導(dǎo)致的損傷會(huì)引起急性炎癥和鈣代謝的平衡失調(diào)[4]。

鈣化多發(fā)生于老年人中，隨著生活水平的提高，血管疾病發(fā)生率呈上升趨勢，而發(fā)病年齡呈年青化趨勢，其中血管鈣化較普遍。許多疾病早期都發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在鈣化發(fā)生過程中同樣起著重要的作用。我們以大鼠動(dòng)脈鈣化為模型，研究了鈣化發(fā)生過程中NALP3炎癥小體復(fù)合物分子的變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料

4周齡SD大鼠，體質(zhì)量150 g左右，訂購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；卵磷脂購自北京化學(xué)試劑公司；豬源膽酸購自國藥集團(tuán)；β-磷酸甘油酯購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；TRIzol購自天根公司；引物由北京奧科公司合成。

1.2 維生素D3注射液的配制

溶液A：0.6 g卵磷脂溶于260 μL無水酒精，制成卵磷脂溶液；25.5 mg VD3溶于卵磷脂溶液，加入0.75 g玉米油，充分振蕩溶解。溶液B：26 mg膽酸溶于7.3 mL生理鹽水。將溶液A溶于溶液B中，在振蕩器上充分振蕩，所得溶液為乳濁注射液。

1.3 大鼠動(dòng)物模型的建立

SD大鼠42只分為對照組和鈣化組，對照組6只，鈣化組36只。鈣化組按時(shí)間梯度（0.5、1、3、7、14、28 d）分為6組，每組6只。鈣化組給予VD3注射液，劑量為30萬U/（kg·d），連續(xù)注射14 d，每天同一時(shí)間皮下注射。在不同時(shí)間點(diǎn)收取鈣化大鼠，取其主動(dòng)脈，放入無RNAase的離心管中，凍存于-80℃。

1.4 HE染色

將制好的石蠟切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脫蠟10 min，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，用1%的鹽酸乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗2 min，伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗5 min，梯度乙醇溶液（50%、70%、80%、95%）脫水，晾干后用中性樹膠封片。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取大鼠動(dòng)脈組織，加入1 mL TRIzol裂解，用玻璃棒研磨，用氯仿和異丙醇抽提總RNA，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀物，DEPC水溶解RNA，-80℃保存。取 2 μg總 RNA，在含 1.5 μL oligo（dT）、5 μL dNTP混合液、1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.625 μL核糖核酸酶抑制劑、5 μL M-MLV緩沖液的20 μL體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因。引物為Rat nalp3-上游（5'GACCAGGAGGTTGTTCAGATCTTC3'）、Rat nalp3-下 游（5'TCCATTCTGGTAGAGAGGTTGATC 3'）、Rat ASC-上游（5'ACCACACCCTTGCACAGCC TATC3'）、Rat ASC-下游（5'CACATTGCCATACAG AGCATCCAG3'）、Rat Caspase-1-上游（5'GTGAGT GTAGGGACAATAAATGGA3'）、Rat Caspase-1- 下游（5'CTAAAGGGCAAAACTTGAGGGAAC3'）、Rat β-actin-上游（5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3'）、β-actin-下游（5'CCCATACCCACCATCACACC3'）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min、95℃變性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)脈鈣化模型的建立

我們以SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象制備動(dòng)物鈣化模型，取其主動(dòng)脈血管制備石蠟切片，HE染色顯示主動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜鈣化情況，見圖1。未給予VD3組大鼠主動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜完整，給予VD3組大鼠主動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜因發(fā)生鈣化而斷裂。

2.2 NALP3炎癥小體相關(guān)基因在鈣化模型中被激活

我們進(jìn)一步確定NALP3炎癥小體在體內(nèi)鈣化模型中的情況。4周齡SD大鼠按不同時(shí)間點(diǎn)（0、0.5、1、3、7、14、28 d）皮下注射VD3，對照組注射除VD3外的溶劑，于不同時(shí)間點(diǎn)處理大鼠。提取大鼠的主動(dòng)脈總RNA，RT-PCR檢測NALP3炎癥小體基因的表達(dá)差異。結(jié)果如圖2所示，以β-actin為內(nèi)參，在0.5 d時(shí)NALP3炎癥小體基因（NALP3、ASC、Cas?pase-1）轉(zhuǎn)錄水平開始上升，并持續(xù)上升至鈣化誘導(dǎo)第7 d，在鈣化后期（14、28 d）轉(zhuǎn)錄水平下降，這表明NALP3炎癥小體在動(dòng)物鈣化早期被激活。

圖1 大鼠鈣化模型的建立

圖2 NALP3炎癥小體在體內(nèi)鈣化模型中被激活

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠動(dòng)脈鈣化模型的制作方法主要有維生素D3加尼古丁法[5]、維生素D3加華法令法[6]和單用維生素D3法[7]。研究表明[8]，維生素D3能顯著促進(jìn)動(dòng)脈鈣化的發(fā)生。經(jīng)皮下注射維生素D3后，血鈣濃度顯著升高，并破壞動(dòng)脈管壁的完整性，但具體機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)采用單用維生素D3法，皮下注射給予實(shí)驗(yàn)組大鼠大劑量VD3，制作了大鼠動(dòng)脈鈣化模型，經(jīng)病理（HE染色）證實(shí)模型制作成功，可見動(dòng)脈中膜彈力層和內(nèi)膜大量被破壞，由于制片過程中有部分鈣鹽脫落，造成中層有空白形成。

炎癥小體是一種胞內(nèi)模式識(shí)別受體復(fù)合物，主要應(yīng)答進(jìn)入胞內(nèi)的病原相關(guān)分子模式（pathogen-as?sociated molecular pattern，PAMP），通過分泌IL-1β參與宿主先天性免疫反應(yīng)。研究表明，一些晶體結(jié)構(gòu)物和外來蛋白聚集體可以激活NALP3信號通路，如尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）和引起自發(fā)炎癥痛風(fēng)和關(guān)節(jié)炎的焦磷酸鈣脫水化合物（calcium pyrophosphate dehydrate，CPPD）都能激活NALP3炎癥小體[9]。我們的實(shí)驗(yàn)表明，大鼠動(dòng)脈鈣化誘導(dǎo)過程中 NALP3、ASC、Caspase-1的轉(zhuǎn)錄水平升高，表明NALP3炎癥小體的相關(guān)基因在鈣化模型中被激活。這些發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步研究動(dòng)脈鈣化的機(jī)制及篩選抗動(dòng)脈硬化藥物打下了基礎(chǔ)。

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