李嶄，李濤，陳芳紅，劉雄，周育森，王慧

1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 5300002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Esche?richia coli，EHEC）O157∶H7作為一種重要的食源性致病菌，其感染特點(diǎn)為世界流行性、高發(fā)病率與病死率，以及抗生素治療會(huì)加劇病情等[1]。自美國(guó)1982年首次暴發(fā)流行以來(lái)，許多國(guó)家相繼發(fā)生了EHEC O157∶H7的感染流行[2]?，F(xiàn)今其感染已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，受到各國(guó)廣泛關(guān)注[3]。對(duì)該菌致病機(jī)制的研究，已成為世界醫(yī)學(xué)界的關(guān)注點(diǎn)[4-6]。

EHEC O157∶H7的致病機(jī)制與其基因組中某些特殊區(qū)域有關(guān)，這些區(qū)域可編碼與EHEC致病性有關(guān)的毒力因子，而毒力島就是這些特殊基因的編碼區(qū)[7]。O157∶H7毒力島包括編碼eae基因的LEE島、前噬菌體上編碼志賀樣毒素（Shiga-like toxin，SLT）的slt基因和大質(zhì)粒（pO157）編碼的hly、katP、espP、toxB、stcE基因等[8]，目前對(duì)EHEC致病機(jī)制的研究主要集中在毒力島編碼系統(tǒng)上[9]。通過(guò)對(duì)毒力島的研究發(fā)現(xiàn)了一些重要的毒力因子，但迄今所發(fā)現(xiàn)的毒力因子不足以解釋0157∶H7的全部致病過(guò)程[10]。

我們通過(guò)對(duì)EHEC毒力島編碼序列的掃描，在毒力島前噬菌體編碼區(qū)志賀樣毒素基因slt上游位置發(fā)現(xiàn)了功能未知的Z1444蛋白基因[11-13]。通過(guò)毒力因子基因同源比對(duì)，分析致病基因保守區(qū)域，預(yù)測(cè)EHEC染色體一段完整基因ORF Z1444具有潛在的致病性，該基因編碼的蛋白很可能參與細(xì)菌與宿主的相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應(yīng)蛋白（毒力因子）。因此，研究0157∶H7 Z1444蛋白，對(duì)于進(jìn)—步了解細(xì)菌與宿主的相互作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

EHEC O157∶H7 EDL933株和 pET-28a（+）載體為本室保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，pEASY-T1載體，Taq酶，dNTP及DNA marker購(gòu)自TransGen公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京博邁德公司；NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；His抗體和磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體分別購(gòu)自CST與Ab?cam公司。

1.2 Z1444基因的擴(kuò)增

根據(jù) GenBank中的 Z1444基因序列（ID：959087）設(shè)計(jì)引物 Z1444（up）（5'-CATATGCTAACT CCATACAAAAG-3'）和 Z1444（down）（5'-CTCGAG GTTATCCTTTAATAACCTATACTG-3'），分別在上下游引物中引入NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線序列）。以EHEC O157∶H7全菌裂解液為模板，Z1444（up）、Z1444（down）為引物擴(kuò)增目的基因。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃停止。取25 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳（116 V），20 min后在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

膠回收PCR產(chǎn)物，與pEasy-T1載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆菌落，以 Z1444（up）、Z1444(down）為引物進(jìn)行 PCR篩選鑒定陽(yáng)性菌株，陽(yáng)性克隆送生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 表達(dá)菌株pET-28a（+）-Z1444/BL21的構(gòu)建

1.3.1 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444的構(gòu)建 將測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒pEasy-T1-Z1444用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到目的片段Z1444，膠回收，用T4DNA連接酶連接經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-28a（+）載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆菌落，以Z1444（up）、Z1444（down）為引物進(jìn)行PCR初篩，NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切復(fù)檢，鑒定陽(yáng)性菌株，陽(yáng)性克隆送生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.2 表達(dá)菌株的構(gòu)建 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日挑取單克隆，以Z1444（up）、Z1444（down）為引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 目的蛋白的表達(dá)與純化

1.4.1 蛋白表達(dá) 鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌株和轉(zhuǎn)入空載體的陰性對(duì)照菌接入新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期時(shí)（D600nm約為0.4），加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，25℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)6 h，5000 r/min離心20 min收集菌體，用1/5體積的PBS重懸菌體，400W功率超聲4個(gè)循環(huán)（工作3 s，間隔5 s，循環(huán)99次），破碎菌體細(xì)胞，5000 r/min離心15 min，分離上清、沉淀，各取20 μL樣品進(jìn)行SDSPAGE（5%濃縮膠和15%分離膠；恒壓110 V，濃縮15 min；恒壓180 V，分離1 h）。

1.4.2 蛋白純化 超聲裂解后上清過(guò)鎳柱（His?Trap FF crude 5 mL）純化，用400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫，取純化后蛋白20 μL進(jìn)行SDS-PAGE。

1.5 純化蛋白的功能初步驗(yàn)證

1.5.1 His標(biāo)簽蛋白的Western印跡 收集純化的蛋白，進(jìn)行15%SDS-PAGE鑒定，并電轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素（PVDF）膜上，用3%BSA封閉（37℃、2 h），加入1∶1000稀釋的兔源抗His抗體（一抗），4℃過(guò)夜，再加入1∶1000稀釋的HRP酶標(biāo)二抗（抗兔），室溫輕搖1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中化學(xué)發(fā)光顯影。

1.5.2 純化蛋白的體外酶活實(shí)驗(yàn) GenBank中Z1444的蛋白功能注釋為絲/蘇氨酸蛋白激酶，因此選取絲/蘇氨酸通用底物髓鞘堿性蛋白（myelin ba?sic protein，MBP）進(jìn)行測(cè)定[14]。首先將 MBP溶于酶活實(shí)驗(yàn)低滲緩沖液［20 mmol/L Hepes（pH7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2］中，然后加入Z1444蛋白，補(bǔ)加50 μmol/L ATP，于30℃反應(yīng)30 min后收集產(chǎn)物，進(jìn)行15%SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用3%BSA封閉（37℃、2 h），加入1∶1000稀釋的鼠源磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體（一抗），4℃過(guò)夜，再加入1∶1000稀釋的HRP酶標(biāo)二抗（抗鼠），室溫輕搖1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a（+）-Z1444原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以EHEC O157∶H7全菌裂解液為模板，Z1444（up）、Z1444（down）為引物PCR擴(kuò)增Z1444基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得約1047 bp的DNA片段，與預(yù)期一致（圖1）。將pET-28a（+）載體與PCR鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒pEasy-T1-Z1444同時(shí)經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，各自膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂板后挑取克隆酶切鑒定，可切出2條片段，分別為長(zhǎng)度約5000 bp的空載體pET-28a（+）和1047 bp的Z1444條帶，重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444作為雙酶切前對(duì)照，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。完成后質(zhì)粒送生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的相應(yīng)堿基序列的一致率為100%（序列略）。

2.2 重組Z1444的表達(dá)和純化

重組菌pET-28a（+）-Z1444/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后制備全菌裂解液，分離沉淀和上清，取樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，可見上清中在相對(duì)分子質(zhì)量約38×103處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期相符（圖3），而沉淀中對(duì)應(yīng)位置并無(wú)顯著條帶。轉(zhuǎn)入空載體的菌體裂解液作為陰性對(duì)照，經(jīng)相同處理后，對(duì)應(yīng)位置無(wú)目的條帶。因此，可以判斷獲得了原核表達(dá)的目的蛋白，且以可溶性形式存在。將重組菌全菌裂解液上清經(jīng)鎳柱純化，去除大量雜蛋白，得到較純的蛋白條帶（圖4），所得蛋白溶液經(jīng)反復(fù)凍融后沒(méi)有出現(xiàn)沉淀，可供后續(xù)試驗(yàn)使用。

圖1 PCR擴(kuò)增Z1444基因

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444的酶切鑒定

2.3 重組Z1444的絲/蘇氨酸激酶活性初步驗(yàn)證

將純化的Z1444蛋白進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)His-Z1444蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖5。同時(shí)將絲/蘇氨酸激酶通用磷酸化底物MBP與Z1444蛋白混合后補(bǔ)加ATP，30℃孵育30 min，完成酶促反應(yīng)，用磷酸絲/蘇氨酸抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，可見Z1444蛋白不僅可以磷酸化通用底物MBP，且Z1444蛋白本身發(fā)生了自磷酸化現(xiàn)象（圖6）。

3 討論

圖3 重組菌pET-28a（+）-Z1444/BL21的蛋白表達(dá)

圖4 重組Z1444蛋白的純化

圖5 Western印跡檢測(cè)His-Z1444蛋白的表達(dá)

圖6 純化的Z1444蛋白的絲/蘇氨酸激酶活性驗(yàn)證

我們通過(guò)寡核苷酸互補(bǔ)原理雙向設(shè)計(jì)引物，從大腸桿菌O157∶H7 EDLL933全基因組中釣取出Z1444基因，利用PCR擴(kuò)增目的基因，選用帶有His標(biāo)簽的pET載體系統(tǒng)構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，然后以大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌進(jìn)行蛋白表達(dá)。我們希望得到高水平表達(dá)的重組蛋白，且最好為可溶性形式，以利于蛋白純化及后續(xù)活性驗(yàn)證。為此，我們進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化。在較高溫度如常規(guī)37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)重組蛋白大多形成包涵體，于是進(jìn)行了溫度梯度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)25℃誘導(dǎo)時(shí)重組蛋白為可溶性表達(dá)，產(chǎn)物表達(dá)量占上清總蛋白的40%左右。后續(xù)采用親和層析NTA His結(jié)合樹脂純化蛋白，配制6種濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行蛋白梯度洗脫純化，發(fā)現(xiàn)400 mmol/L咪唑洗脫液具有優(yōu)勢(shì)，可除去大部分雜蛋白，特異性較好，可獲得純度較高的蛋白。Z1444蛋白在原核系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)，為后續(xù)蛋白活性研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

O157∶H7是EHEC的主要血清型，能引起人的出血性結(jié)腸炎和溶血性尿路綜合征[15]。EHEC可以產(chǎn)生毒力極強(qiáng)的志賀毒素，且具有黏附上皮細(xì)胞的能力，感染人或動(dòng)物時(shí)黏附到腸黏膜上皮細(xì)胞，然后在此定居，釋放外毒素，從而引起疾病[16-17]。毒力島是與細(xì)菌致病性和毒力因子密切相關(guān)的基因簇[18-19]，獲得EHEC O157：H7毒力島上某些基因的可溶性原核表達(dá)，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)有助于探索基因與菌株致病性之間的相互關(guān)聯(lián)。

綜上所述，我們構(gòu)建了pET-28a（+）-Z1444重組表達(dá)載體，并篩選獲得了高效原核表達(dá)工程菌，建立了簡(jiǎn)便可行的蛋白純化工藝，獲得了濃度純度在90%以上的Z1444蛋白，為進(jìn)一步研究Z1444蛋白在大腸桿菌與宿主相互作用時(shí)所起的功能奠定了基礎(chǔ)。我們還通過(guò)Western印跡驗(yàn)證了GenBank對(duì)Z1444蛋白的功能注釋，發(fā)現(xiàn)該蛋白不僅可以磷酸化通用底物MBP，而且蛋白本身也發(fā)生自磷酸化現(xiàn)象?？紤]到這些特殊的酶活效應(yīng)，對(duì)其蛋白生物學(xué)活性的進(jìn)一步驗(yàn)證顯得尤為重要，這將有助于了解功能未知毒力因子在細(xì)菌感染時(shí)的作用機(jī)制。

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