李嶄，李濤，陳芳紅，劉雄，周育森，王慧

1.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 5300002；2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Esche?richia coli，EHEC）O157∶H7作為一種重要的食源性致病菌，其感染特點為世界流行性、高發(fā)病率與病死率，以及抗生素治療會加劇病情等[1]。自美國1982年首次暴發(fā)流行以來，許多國家相繼發(fā)生了EHEC O157∶H7的感染流行[2]。現(xiàn)今其感染已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，受到各國廣泛關(guān)注[3]。對該菌致病機制的研究，已成為世界醫(yī)學界的關(guān)注點[4-6]。

EHEC O157∶H7的致病機制與其基因組中某些特殊區(qū)域有關(guān)，這些區(qū)域可編碼與EHEC致病性有關(guān)的毒力因子，而毒力島就是這些特殊基因的編碼區(qū)[7]。O157∶H7毒力島包括編碼eae基因的LEE島、前噬菌體上編碼志賀樣毒素（Shiga-like toxin，SLT）的slt基因和大質(zhì)粒（pO157）編碼的hly、katP、espP、toxB、stcE基因等[8]，目前對EHEC致病機制的研究主要集中在毒力島編碼系統(tǒng)上[9]。通過對毒力島的研究發(fā)現(xiàn)了一些重要的毒力因子，但迄今所發(fā)現(xiàn)的毒力因子不足以解釋0157∶H7的全部致病過程[10]。

我們通過對EHEC毒力島編碼序列的掃描，在毒力島前噬菌體編碼區(qū)志賀樣毒素基因slt上游位置發(fā)現(xiàn)了功能未知的Z1444蛋白基因[11-13]。通過毒力因子基因同源比對，分析致病基因保守區(qū)域，預測EHEC染色體一段完整基因ORF Z1444具有潛在的致病性，該基因編碼的蛋白很可能參與細菌與宿主的相互作用，并且可能是具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的致病菌重要的效應(yīng)蛋白（毒力因子）。因此，研究0157∶H7 Z1444蛋白，對于進—步了解細菌與宿主的相互作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

EHEC O157∶H7 EDL933株和 pET-28a（+）載體為本室保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞，pEASY-T1載體，Taq酶，dNTP及DNA marker購自TransGen公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京博邁德公司；NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶購自NEB公司；His抗體和磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體分別購自CST與Ab?cam公司。

1.2 Z1444基因的擴增

根據(jù) GenBank中的 Z1444基因序列（ID：959087）設(shè)計引物 Z1444（up）（5'-CATATGCTAACT CCATACAAAAG-3'）和 Z1444（down）（5'-CTCGAG GTTATCCTTTAATAACCTATACTG-3'），分別在上下游引物中引入NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點（下劃線序列）。以EHEC O157∶H7全菌裂解液為模板，Z1444（up）、Z1444（down）為引物擴增目的基因。PCR條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃復性30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃停止。取25 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳（116 V），20 min后在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

膠回收PCR產(chǎn)物，與pEasy-T1載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆菌落，以 Z1444（up）、Z1444(down）為引物進行 PCR篩選鑒定陽性菌株，陽性克隆送生工生物工程有限公司測序。

1.3 表達菌株pET-28a（+）-Z1444/BL21的構(gòu)建

1.3.1 表達質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444的構(gòu)建 將測序正確的克隆質(zhì)粒pEasy-T1-Z1444用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到目的片段Z1444，膠回收，用T4DNA連接酶連接經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-28a（+）載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆菌落，以Z1444（up）、Z1444（down）為引物進行PCR初篩，NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切復檢，鑒定陽性菌株，陽性克隆送生工生物工程有限公司測序。

1.3.2 表達菌株的構(gòu)建 將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（37℃、200 r/min），次日挑取單克隆，以Z1444（up）、Z1444（down）為引物進行PCR鑒定。

1.4 目的蛋白的表達與純化

1.4.1 蛋白表達 鑒定為陽性的單克隆菌株和轉(zhuǎn)入空載體的陰性對照菌接入新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期前期時（D600nm約為0.4），加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，25℃、200 r/min條件下誘導6 h，5000 r/min離心20 min收集菌體，用1/5體積的PBS重懸菌體，400W功率超聲4個循環(huán)（工作3 s，間隔5 s，循環(huán)99次），破碎菌體細胞，5000 r/min離心15 min，分離上清、沉淀，各取20 μL樣品進行SDSPAGE（5%濃縮膠和15%分離膠；恒壓110 V，濃縮15 min；恒壓180 V，分離1 h）。

1.4.2 蛋白純化 超聲裂解后上清過鎳柱（His?Trap FF crude 5 mL）純化，用400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫，取純化后蛋白20 μL進行SDS-PAGE。

1.5 純化蛋白的功能初步驗證

1.5.1 His標簽蛋白的Western印跡 收集純化的蛋白，進行15%SDS-PAGE鑒定，并電轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素（PVDF）膜上，用3%BSA封閉（37℃、2 h），加入1∶1000稀釋的兔源抗His抗體（一抗），4℃過夜，再加入1∶1000稀釋的HRP酶標二抗（抗兔），室溫輕搖1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中化學發(fā)光顯影。

1.5.2 純化蛋白的體外酶活實驗 GenBank中Z1444的蛋白功能注釋為絲/蘇氨酸蛋白激酶，因此選取絲/蘇氨酸通用底物髓鞘堿性蛋白（myelin ba?sic protein，MBP）進行測定[14]。首先將 MBP溶于酶活實驗低滲緩沖液［20 mmol/L Hepes（pH7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2］中，然后加入Z1444蛋白，補加50 μmol/L ATP，于30℃反應(yīng)30 min后收集產(chǎn)物，進行15%SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用3%BSA封閉（37℃、2 h），加入1∶1000稀釋的鼠源磷酸絲氨酸/蘇氨酸抗體（一抗），4℃過夜，再加入1∶1000稀釋的HRP酶標二抗（抗鼠），室溫輕搖1 h，用TBST洗膜后，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中化學發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a（+）-Z1444原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以EHEC O157∶H7全菌裂解液為模板，Z1444（up）、Z1444（down）為引物PCR擴增Z1444基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得約1047 bp的DNA片段，與預期一致（圖1）。將pET-28a（+）載體與PCR鑒定陽性的質(zhì)粒pEasy-T1-Z1444同時經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，各自膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂板后挑取克隆酶切鑒定，可切出2條片段，分別為長度約5000 bp的空載體pET-28a（+）和1047 bp的Z1444條帶，重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444作為雙酶切前對照，符合預期結(jié)果（圖2）。完成后質(zhì)粒送生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的相應(yīng)堿基序列的一致率為100%（序列略）。

2.2 重組Z1444的表達和純化

重組菌pET-28a（+）-Z1444/BL21經(jīng)IPTG誘導表達后制備全菌裂解液，分離沉淀和上清，取樣品進行SDS-PAGE鑒定，可見上清中在相對分子質(zhì)量約38×103處有明顯的蛋白條帶，與預期相符（圖3），而沉淀中對應(yīng)位置并無顯著條帶。轉(zhuǎn)入空載體的菌體裂解液作為陰性對照，經(jīng)相同處理后，對應(yīng)位置無目的條帶。因此，可以判斷獲得了原核表達的目的蛋白，且以可溶性形式存在。將重組菌全菌裂解液上清經(jīng)鎳柱純化，去除大量雜蛋白，得到較純的蛋白條帶（圖4），所得蛋白溶液經(jīng)反復凍融后沒有出現(xiàn)沉淀，可供后續(xù)試驗使用。

圖1 PCR擴增Z1444基因

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Z1444的酶切鑒定

2.3 重組Z1444的絲/蘇氨酸激酶活性初步驗證

將純化的Z1444蛋白進行Western印跡，檢測His-Z1444蛋白表達，結(jié)果見圖5。同時將絲/蘇氨酸激酶通用磷酸化底物MBP與Z1444蛋白混合后補加ATP，30℃孵育30 min，完成酶促反應(yīng)，用磷酸絲/蘇氨酸抗體進行Western印跡檢測，可見Z1444蛋白不僅可以磷酸化通用底物MBP，且Z1444蛋白本身發(fā)生了自磷酸化現(xiàn)象（圖6）。

3 討論

圖3 重組菌pET-28a（+）-Z1444/BL21的蛋白表達

圖4 重組Z1444蛋白的純化

圖5 Western印跡檢測His-Z1444蛋白的表達

圖6 純化的Z1444蛋白的絲/蘇氨酸激酶活性驗證

我們通過寡核苷酸互補原理雙向設(shè)計引物，從大腸桿菌O157∶H7 EDLL933全基因組中釣取出Z1444基因，利用PCR擴增目的基因，選用帶有His標簽的pET載體系統(tǒng)構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒，然后以大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌進行蛋白表達。我們希望得到高水平表達的重組蛋白，且最好為可溶性形式，以利于蛋白純化及后續(xù)活性驗證。為此，我們進行了表達條件的優(yōu)化。在較高溫度如常規(guī)37℃誘導表達時發(fā)現(xiàn)重組蛋白大多形成包涵體，于是進行了溫度梯度誘導實驗，發(fā)現(xiàn)25℃誘導時重組蛋白為可溶性表達，產(chǎn)物表達量占上清總蛋白的40%左右。后續(xù)采用親和層析NTA His結(jié)合樹脂純化蛋白，配制6種濃度的咪唑洗脫液進行蛋白梯度洗脫純化，發(fā)現(xiàn)400 mmol/L咪唑洗脫液具有優(yōu)勢，可除去大部分雜蛋白，特異性較好，可獲得純度較高的蛋白。Z1444蛋白在原核系統(tǒng)中的高效可溶性表達，為后續(xù)蛋白活性研究提供了良好的實驗材料。

O157∶H7是EHEC的主要血清型，能引起人的出血性結(jié)腸炎和溶血性尿路綜合征[15]。EHEC可以產(chǎn)生毒力極強的志賀毒素，且具有黏附上皮細胞的能力，感染人或動物時黏附到腸黏膜上皮細胞，然后在此定居，釋放外毒素，從而引起疾病[16-17]。毒力島是與細菌致病性和毒力因子密切相關(guān)的基因簇[18-19]，獲得EHEC O157：H7毒力島上某些基因的可溶性原核表達，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)，同時有助于探索基因與菌株致病性之間的相互關(guān)聯(lián)。

綜上所述，我們構(gòu)建了pET-28a（+）-Z1444重組表達載體，并篩選獲得了高效原核表達工程菌，建立了簡便可行的蛋白純化工藝，獲得了濃度純度在90%以上的Z1444蛋白，為進一步研究Z1444蛋白在大腸桿菌與宿主相互作用時所起的功能奠定了基礎(chǔ)。我們還通過Western印跡驗證了GenBank對Z1444蛋白的功能注釋，發(fā)現(xiàn)該蛋白不僅可以磷酸化通用底物MBP，而且蛋白本身也發(fā)生自磷酸化現(xiàn)象。考慮到這些特殊的酶活效應(yīng)，對其蛋白生物學活性的進一步驗證顯得尤為重要，這將有助于了解功能未知毒力因子在細菌感染時的作用機制。

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