李佳林，張存，高源，郝強(qiáng)，王舒寧，張偉，張英起

1.腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；陜西 西安 710032

白細(xì)胞介素15（interleukin-15，IL-15）是一種多功能細(xì)胞因子，是1994年Grabstein等從猿猴的腎上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，相對(duì)分子質(zhì)量為（14～15）×103[1]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的發(fā)育、功能維持方面發(fā)揮重要作用，被看作是天然免疫與獲得性免疫系統(tǒng)之間的紐帶之一[2]，因此在維持自身免疫系統(tǒng)平衡及治療腫瘤、微生物感染、自身免疫病等方面?zhèn)涫荜P(guān)注[3-5]。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見(jiàn)的累及外周關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥的自身免疫性疾病。大量文獻(xiàn)報(bào)道，RA患者血清中IL-15水平明顯增高，且過(guò)量表達(dá)的IL-15通過(guò)多種途徑參與RA的發(fā)病機(jī)制[6]。首先，IL-15可以通過(guò)與多種細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，RA中高濃度的IL-15能誘導(dǎo)炎性因子IL-17的過(guò)度分泌。IL-15還能一方面直接活化T細(xì)胞誘導(dǎo)其合成腫瘤壞死因子α（TNFα），另一方面通過(guò)激活NK細(xì)胞，通過(guò)其與單核細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)TNFα的產(chǎn)生[7-9]。另外，IL-15還參與關(guān)節(jié)骨質(zhì)的破壞。IL-15可以一方面通過(guò)激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB等信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，另一方面與其他分子相互作用促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡；還可通過(guò)增加基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，造成骨質(zhì)損傷[6,10-11]。因此，IL-15已成為RA治療的重要靶點(diǎn)。我們從主動(dòng)免疫方向入手，通過(guò)融合破傷風(fēng)類(lèi)毒素（tetanus toxoid，TT）T輔助細(xì)胞表位（830～843，QYIKANSKFIGITE），在體外克隆表達(dá)了重組人TTIL-15融合蛋白（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為rtIL-15），并通過(guò)免疫小鼠檢測(cè)其免疫原性，為進(jìn)一步研究IL-15融合蛋白在治療RA中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，6～8周齡）購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌M15、質(zhì)粒pQE-30均由本教研室保存；限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA marker DL2000均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）、瓊脂糖、瓊脂購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；重組人IL-15及小鼠抗人IL-15單克隆抗體購(gòu)自R&D公司；氫氧化鋁佐劑購(gòu)自Brenntag公司。

1.2 pQE-30-TT-IL-15重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將GenBank中人IL-15基因序列（342 bp）上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和TT 830～843表位，下游引入SalⅠ酶切位點(diǎn)，長(zhǎng)度共計(jì)399 bp的基因序列交由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，克隆入載體pQE-30，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆培養(yǎng)。經(jīng)酶切鑒定及上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司DNA測(cè)序證實(shí)，得到重組融合表達(dá)載體pQE-30-TT-IL-15，其中pQE-30載體N端融合6個(gè)His。

1.3 rtIL-15在大腸桿菌中的表達(dá)

將含pQE-30-TT-IL-15重組質(zhì)粒的工程菌接種于10 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1%的比例轉(zhuǎn)種于10 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，于37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期（D600nm約為0.6），加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE鑒定，并用灰度掃描軟件分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。

1.4 rtIL-15融合蛋白的純化、復(fù)性和鑒定

1.4.1 rtIL-15融合蛋白的純化、復(fù)性 將誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌液于4℃、4000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀，超聲波裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達(dá)形式。將沉淀用包涵體洗滌液A（2 mol/L尿素，2%Triton X-100）洗滌2次，離心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，離心后取上清進(jìn)行鎳柱（Ni-NTA）親和層析純化，分別用10、25 mmol/L咪唑預(yù)洗脫之后，用250 mmol/L咪唑再次洗脫，收集目的蛋白進(jìn)行梯度透析復(fù)性（尿素濃度依次為6、4、2、0 mol/L），最后透析至Tris緩沖液中，-20℃保存。

1.4.2 rtIL-15融合蛋白的Weatern印跡 將純化的rtIL-15行SDS-PADE，隨后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以小鼠抗IL-15單抗為一抗、HRP-兔抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western印跡。

1.4.3 rtIL-15融合蛋白的HPLC純度鑒定 取10 μL純化的蛋白樣品（0.5 mg/mL）上樣至Beckman HPLC系統(tǒng)，使用7.5 mm×300 mm G2000SW凝膠柱，在280 nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)出峰情況，通過(guò)計(jì)算峰面積得出rtIL-15蛋白的純度。

1.5 rtIL-15疫苗的免疫原性測(cè)定

1.5.1 免疫小鼠 將18只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別為rtIL-15+氫氧化鋁佐劑組（蛋白與氫氧化鋁按體積比1∶1混合）、rtIL-15組和生理鹽水對(duì)照組。背部皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠每次免疫40 μg rtIL-15/100 μL或100 μL生理鹽水（對(duì)照組），每組免疫4次，每次間隔2周。第4次免疫后10 d摘眼球采血，收集抗血清進(jìn)行鑒定。

1.5.2 ELISA測(cè)定血清抗體滴度 用商品化的IL-15溶液包被96孔板（每孔100 ng/100 μL），將不同組別的小鼠血清梯度稀釋后加入孔中與其結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的二抗（博士德公司），OPD顯色，測(cè)定D490nm值，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定

pQE-30-TT-IL-15重組表達(dá)載體（圖1）構(gòu)建完成后，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在390 bp處出現(xiàn)酶切片段，與預(yù)期一致（圖2）。測(cè)序結(jié)果也顯示序列正確。

2.2 rtIL-15融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

工程菌經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)2、3、4 h后進(jìn)行SDSPAGE，出現(xiàn)一條相對(duì)分子質(zhì)量約14 000的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明rtIL-15在大腸桿菌中得到表達(dá)，并且誘導(dǎo)4 h后的表達(dá)量最高（圖3）。灰度掃描分析，融合蛋白約占菌體總蛋白的20%。收集菌體進(jìn)行超聲波裂解，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在，細(xì)菌裂解液上清中（可溶性表達(dá)部分）只有少量目的蛋白（圖3）。

圖1 pQE-30-TT-IL-15重組載體結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 rtIL-15融合蛋白的純化、復(fù)性和鑒定

用洗滌液A洗滌包涵體2次，離心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，離心后取上清進(jìn)行鎳柱純化，收集目的蛋白洗脫峰（圖4）。將所得蛋白溶液進(jìn)行梯度透析復(fù)性，最后溶于Tris溶液。將純化復(fù)性后的目的蛋白進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示目的蛋白與抗IL-15單抗有特異性結(jié)合（圖5）。經(jīng)HPLC測(cè)定，目的蛋白純度達(dá)到95%以上（圖6）。

2.4 rtIL-15融合蛋白疫苗免疫原性檢測(cè)

為了驗(yàn)證rtIL-15的免疫原性，也同時(shí)驗(yàn)證氫氧化鋁免疫佐劑的作用，分別用rtIL-15+佐劑、rtIL-15和生理鹽水免疫BALB/c小鼠，免疫4次后取小鼠血清，用ELISA檢測(cè)抗體滴度，結(jié)果如圖7所示?？寡逯械亩嗫古cIL-15有較好的結(jié)合活性；rtIL-15+佐劑組和rtIL-15組產(chǎn)生的抗IL-15抗體效價(jià)分別為1∶100 000和1∶1000。該結(jié)果說(shuō)明rtIL-15融合蛋白疫苗確實(shí)具有免疫原性，并且氫氧化鋁佐劑確實(shí)具有增強(qiáng)免疫效果的作用。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30-TT-IL-15的酶切鑒定

圖3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)（左）及超聲波裂解（右）的SDS-PADE分析

圖4 目的蛋白親和層析純化的SDA-PADE

3 討論

圖5 純化的目的蛋白的Western印跡

圖6 純化的目的蛋白的HPLC分析

圖7 ELISA檢測(cè)rtIL-15的免疫原性

IL-15作為一種重要的前炎性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥發(fā)展、刺激淋巴細(xì)胞滑膜細(xì)胞、促進(jìn)骨質(zhì)破壞等作用，與RA有密切關(guān)系，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。針對(duì)IL-15的單克隆抗體（AMG714）、IL-15受體γc亞單元的單抗及與IL-15受體特異性結(jié)合的IL-15融合蛋白（IL-15-Fcγ2a）都處于臨床研究中[12-13]。但是，這些免疫治療方法具有用藥量大、病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重的缺陷。我們從激發(fā)患者自身免疫反應(yīng)入手，擬發(fā)展一種具有治療作用的IL-15疫苗，可以降低用藥量，從而減輕病人身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但I(xiàn)L-15是一種自身蛋白，正常情況下機(jī)體對(duì)其存在免疫耐受。我們采取了融合外源性通用T輔助細(xì)胞表位的方法突破機(jī)體的免疫耐受，這種策略已成功地應(yīng)用于TNFα、HER2、B7-H1等多種自體疫苗的研究中，并取得了不錯(cuò)的效果[14-16]。

我們將人IL-15基因克隆到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pQE-30上，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了重組人IL-15融合蛋白，但表達(dá)形式為包涵體沉淀，為蛋白純化增加了難度。為了達(dá)到更好的鎳柱親和層析效果，我們嘗試了不同的包涵體洗滌策略，分別在緩沖液加入不同濃度的尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇、Triton X-100、脫氧膽酸鈉進(jìn)行摸索，最后發(fā)現(xiàn)含2 mol/L尿素、2%Triton X-100的洗滌液可以在不損失目的蛋白的情況下最大程度地去除雜蛋白。在8 mol/L尿素的強(qiáng)變性條件下，目的蛋白沉淀的二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開(kāi)，His標(biāo)簽得以完全暴露，經(jīng)過(guò)一次親和層析就能達(dá)到95%純度的純化效果。最后，經(jīng)過(guò)緩慢的梯度透析，獲得了可溶性的目的蛋白純品。純化后的rtIL-15融合蛋白疫苗在氫氧化鋁佐劑存在的條件下免疫小鼠，誘導(dǎo)出高滴度的IL-15特異性抗體，說(shuō)明rtIL-15融合蛋白疫苗具有很好的免疫原性。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步系統(tǒng)檢測(cè)rtIL-15疫苗在RA動(dòng)物模型中的治療效果及免疫機(jī)制，為其真正應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

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