李杰，張義全，高鶴，王麗，胡小許 ，周冬生

1.中國疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

基因是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，它通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而對生物體表型產(chǎn)生專一性效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄是DNA指導(dǎo)下的RNA合成過程，起始于DNA模板的一個特定起點(diǎn)，即基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。對原核生物而言，其mRNA 5′端的堿基即為其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

在前期研究中[1-5]，我們通常采用引物延伸實(shí)驗(yàn)來確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。但引物延伸實(shí)驗(yàn)需要利用放射性核素對特異性引物的5′端進(jìn)行標(biāo)記，這不僅極易產(chǎn)生放射性廢物污染，而且對實(shí)驗(yàn)者的健康也有較大傷害。因此，該方法并不是尋找基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最優(yōu)選擇。5′-cDNA末端快速擴(kuò)增（5′-rapid-amplification of cDNA ends，5′-RACE）實(shí)驗(yàn)也可以用來確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，該方法通過在mRNA的5′端連接接頭（Adapter），而后聯(lián)合利用逆轉(zhuǎn)錄、巢式PCR和DNA測序技術(shù)，即可最終確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。然而，目前市售5′-RACE試劑盒均是針對真核生物mRNA的帽子結(jié)構(gòu)而設(shè)計的。由于細(xì)菌的mRNA無帽子結(jié)構(gòu)，市售試劑盒并不能直接應(yīng)用于原核生物。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP菌）是一種廣泛分布于淺海海域及海產(chǎn)品中的革蘭陰性弧菌，也是引起食物中毒的首要病原菌，能引起以腹瀉為主要癥狀的急性胃腸炎[6]。VP菌具有多種毒力因子，主要包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS1和T3SS2）、直接耐熱溶血素（TDH）和TDH相關(guān)溶血素（TRH）。ToxR（VP0820編碼）是VP菌的毒力轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，能調(diào)節(jié)TDH和T3SS1相關(guān)基因的表達(dá)[7-8]。VP菌具有很強(qiáng)的生物膜形成能力，以抵抗不利的生存環(huán)境。作為第二信使，c-di-GMP能促進(jìn)生物膜的形成。VP菌有數(shù)十個蛋白參與c-di-GMP的分子代謝，包括ScrC[9]、ScrG[10]及 VPA0198。ScrC 由操縱子 scrABC編碼，主要具有磷酸二酯酶活性，能降解c-di-GMP，抑制胞外多糖CPS（cps操縱子編碼，cpsA是其首基因）的合成，從而抑制生物膜的形成[9，11]；ScrG也主要表現(xiàn)為磷酸二酯酶活性，參與降解c-di-GMP[10]；VPA0198在c-di-GMP代謝中的功能還不是很清楚，可能主要參與c-di-GMP的合成。VP菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2（T6SS2）基因位點(diǎn)包含3個操縱子，分別為VPA1027-1024、VPA1043-1028和VPA1044-1046，該系統(tǒng)是其主要的黏附因子之一[12]。

在本研究中，我們以VP菌VP0820、VPA1027、scrC、scrG、cpsA及VPA0198為研究對象，在Ambion公司FirstChoice RLM-RACE試劑盒基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，摸索出一個適用于原核生物的5′-RACE實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

VP 菌 RIMD2210633（tdh+，KP+）和大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；HI肉湯培養(yǎng)基（2.5%Difco Heart Infusion Broth）購自BD公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品；DNA-free試劑盒和FirstChoice RLM-RACE試劑盒為Ambion公司產(chǎn)品；TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy Vector SystemⅠ（T載體）、Primer Extension System、fmol DNA Cycle Sequencing System等為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與RNA提取

取20 μL甘油菌種接種于15 mL HI肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h（至平臺期），而后以1∶1000稀釋，接種至新鮮的15 mL HI肉湯中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至D600nm約為1.0，收集菌體，用TRIzol試劑[1]提取細(xì)菌總RNA，總RNA質(zhì)量用1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測。

1.3 消化DNA

用DNA-free試劑盒去除總RNA中的DNA，50 μL 實(shí)驗(yàn)體系包括 5 μL 10×DNaseⅠ緩沖液、2.5 μL rDNaseⅠ、6～8 μg總RNA、1 μL RNase抑制劑，用無核酸酶水補(bǔ)足。37℃孵育30 min后，加入100 μL無核酸酶水和150 μL酚∶氯仿（1∶1），充分混勻，室溫12 000 r/min離心5 min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入150 μL氯仿，充分混勻，離心后取上層水相，加入150 μL異丙醇，充分混勻，12 000 r/min離心20 min，RNA沉淀用0.5 mL 70%乙醇漂洗1次，最后用10 μL無核酸酶水溶解。

1.4 Adapter的連接

將已知序列的寡核苷酸片段（Adapter）連接至RNA的5′端，反應(yīng)體系包括4 μL總RNA、1 μL 5′-RACE Adapter、1 μL 10×RNA 連接酶緩沖液、2 μL T4RNA連接酶（2.5 U/μL），補(bǔ)加無核酸酶水至10 μL。溫和混勻，37℃孵育1 h后，直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將連接有Adapter的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系包括 2 μL 上述經(jīng)處理的總 RNA、4 μL dNTP、2 μL 隨機(jī)十聚體（random decamers）、2 μL 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL RNase抑制劑、1 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)加無核酸酶水至20 μL。輕輕混勻，42℃孵育1 h。cDNA產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)。此步應(yīng)有不加逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照。

1.6 巢式PCR反應(yīng)

采用巢式PCR方法擴(kuò)增目的基因。第一輪PCR體系包括0.5 μL cDNA模板、2.5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL dNTP、10 μmol/L基因特異性外引物和位于Adpater上的外引物（表1）各1 μL、0.75 U DNA聚合酶，補(bǔ)加去離子水至25 μL。第二輪PCR體系包括0.5 μL第一輪PCR產(chǎn)物（無須純化回收）、5 μL 10×PCR緩沖液、4 μL dNTP、10 μmol/L基因特異性內(nèi)引物和位于Adpater上的內(nèi)引物（表1）各2 μL、1.25 U DNA聚合酶，補(bǔ)加去離子水至50 μL。PCR 反應(yīng)程序均為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃50 s，72℃ 50 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。第二輪產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后待用。

1.7 PCR產(chǎn)物連接至T載體

將回收的第二輪PCR產(chǎn)物直接連接至T載體，連接體系包括 100～200 ng DNA 片段、1 μL T載體、5 μL 2×DNA連接酶緩沖液、1 μL T4DNA連接酶（2.5 U/μL），補(bǔ)加去離子水至10 μL。輕微混勻后，置10℃連接4 h以上。采用熱沖擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并用氨芐西林（100 μg/mL）抗性平板篩選抗性克隆，PCR鑒定（鑒定引物對同第二輪PCR）陽性者測序。

1.8 引物延伸實(shí)驗(yàn)

將與VPA1027 mRNA互補(bǔ)的特異性引物（表1）的5′端用［γ-32P］ATP（5000 Ci/mmol）進(jìn)行放射性標(biāo)記[13]，并將其退火到mRNA上，進(jìn)而將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配伍測序條帶進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，通過引物延伸條帶的位置即可確定VPA1027轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 cDNA中無基因組DNA污染

總RNA用50 μL無核酸酶水溶解后，其濃度應(yīng)在1000 ng/μL以上，且經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測無降解后，方可滿足下一步實(shí)驗(yàn)需要?？俁NA經(jīng)DNA-free試劑盒消化及連接Adapter后，直接逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后通過RT-PCR方法驗(yàn)證cDNA中是否有DNA污染，結(jié)果見圖1，以cDNA+和基因組DNA為模板時，均能擴(kuò)增出同理論值大小一致的產(chǎn)物（231 bp），而以cDNA-和水為模板時，均不能擴(kuò)增出條帶，這說明cDNA中無基因組DNA污染，可用作5′-RACE實(shí)驗(yàn)的模板。

表1 本研究所用引物序列

2.2 靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

采用巢式PCR擴(kuò)增目的基因片段，如圖2A所示，VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198均擴(kuò)增出明亮的產(chǎn)物條帶，但scrA條帶拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重。將上述PCR產(chǎn)物直接與T載體連接，篩選鑒定陽性者送公司測序。圖2B～F分別為VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的測序結(jié)果，分別與標(biāo)準(zhǔn)序列（DNA）比對，并根據(jù)Adapter序列，可以得出它們的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為G（-103）、G（-70）、T（-205）、C（-129）和G（-238）（翻譯起始位點(diǎn)為+1）。

2.3 引物延伸驗(yàn)證VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

圖3為VPA1027的引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，若以翻譯起始位點(diǎn)為+1，則VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為-103位的G，這與5′-RACE的結(jié)果一致，說明5′-RACE得到的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是可靠的。

2.4 靶基因的啟動子區(qū)序列

通過轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)查詢基因的核心啟動子區(qū)，可以反向驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的正確性。圖4為VPA1027、scrG、scrA、cpsA和VPA0198的啟動子區(qū)序列?？梢钥闯?，scrG、cpsA和VPA0198均具有比較保守的-10（TATAAT）和-35（TTGACA）序列，這說明了其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的可靠性；但VPA1027和scrA只有相對保守的-10序列，而-35序列保守性較差，這說明在生理條件下，它們的轉(zhuǎn)錄啟動可能需要反式激活因子的輔助才能完成。

3 討論

市售5′-RACE試劑盒是依據(jù)真核生物mRNA的帽子結(jié)構(gòu)而設(shè)計的。無帽子結(jié)構(gòu)的DNA片段、rRNA及tRNA的5′端磷酸基團(tuán)極易被牛小腸堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIP）水解，而帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA則不受影響。但是，mRNA的帽子結(jié)構(gòu)能被煙草酸焦磷酸酶（tobacco acid py?rophosphatase，TAP）水解，并留下5′端磷酸基團(tuán)。因此，可以依次用CIP和TAP處理總RNA，再利用T4RNA連接酶將一個已知序列的寡核苷酸序列（Adapter）連接至mRNA的5′端磷酸基團(tuán)上，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過巢式PCR和DNA測序的方法即可確定mRNA的5′末端。由于原核生物的mRNA的無帽子結(jié)構(gòu)，市售5′-RACE試劑盒并不能直接應(yīng)用于原核生物mRNA的5′末端堿基的確定。我們在Ambion公司FirstChoice RLM-RACE試劑盒的基礎(chǔ)上，拋棄CIP和TAP處理總RNA的步驟，利用Ambion公司的DNA-free試劑盒去除總RNA中污染的DNA，而后直接將Adapter接頭連接至mRNA 5′末端，再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過巢式PCR及測序的方法，成功定位了副溶血弧菌VPA1027、scrA、scrG、cpsA和VPA0198的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并通過引物延伸的方法驗(yàn)證了VPA1027的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。優(yōu)化后的方案不僅操作更簡單，而且應(yīng)可適用于所有原核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位。

圖1 VP0820的RT-PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 第二輪PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖（A）及測序圖譜（B～F）

圖3 VPA1027的引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 靶基因啟動子區(qū)序列

引物延伸和5′-RACE實(shí)驗(yàn)是尋找基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的兩個常用方法，二者各有優(yōu)缺點(diǎn)。引物延伸實(shí)驗(yàn)是一個逆轉(zhuǎn)錄的過程，其所得cDNA的量和mRNA的起始量成正比，因此它不僅可用來定位基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，還可用于研究調(diào)控子對靶基因的調(diào)控關(guān)系[1-5,14-16]。然而，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)搜尋的過程中，需要針對每個待研究的基因設(shè)計多條引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)財、成功率低，且易產(chǎn)生放射性污染，對實(shí)驗(yàn)者的健康也有損傷。5′-RACE實(shí)驗(yàn)雖然成功率高、避免了放射性同位素帶來的不便，但是它所得到的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)受mRNA降解片段的影響，易出現(xiàn)假陽性，而且也不能用于研究調(diào)控子對靶基因的調(diào)控關(guān)系。基于此，最合理的方法是將5′-RACE實(shí)驗(yàn)和引物延伸實(shí)驗(yàn)緊密結(jié)合起來，首先利用5′-RACE實(shí)驗(yàn)找出靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，再針對該位點(diǎn)設(shè)計特異性引物，利用引物延伸實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而可以大大提高引物延伸實(shí)驗(yàn)的成功率。

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