朱羿龍，李昌，劉存霞，杜壽文 ，王茂鵬，葉飛，譚鵬，邢彬，劉繼，朱光澤，郭焱，金寧一

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2010年新感染人免疫缺陷病毒（HIV）的患者約270萬人，而截至2010年底，約有3400萬人攜帶HIV，所以迫切需要安全、有效的疫苗來應(yīng)對(duì)HIV的蔓延。但是，由于抗原表位的時(shí)常突變、免疫原性弱，以及疫苗所誘導(dǎo)的抗原免疫反應(yīng)時(shí)間短等原因，導(dǎo)致疫苗研發(fā)屢遭挫敗[1-3]。對(duì)于其他病毒傳染病，如麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹等，這種類似于免疫原性的問題是通過發(fā)展減毒疫苗株來解決的[4]，但是對(duì)于HIV和猴免疫缺陷病毒（SIV）而言，減毒活疫苗雖然很具有吸引力[5-6]，但卻存在前病毒整合和某些情況下轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧局甑娘L(fēng)險(xiǎn)[7]。相反，活病毒在作為HIV疫苗載體時(shí)具備了相當(dāng)優(yōu)秀的免疫原性[8-11]，其中以禽痘病毒為載體的HIV疫苗已開始臨床應(yīng)用，如Aventis Pasteur公司開發(fā)的重組金絲雀病毒載體ALVAC與gp120亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用，并均可在受試者中檢測到CTL反應(yīng)[12]。

SIV與HIV-1具有一定的同源性，部分SIV毒株接種于亞洲猴子，會(huì)使其感染并產(chǎn)生類似艾滋病的癥狀[13]，因此，用SIV感染亞洲猴屬作為模型被推薦替代HIV-1感染，使得SIV作為HIV的模式病毒在疫苗領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。包膜糖蛋白（Env）在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用，我們以SIV env作為目的基因，以中國雞痘病毒（fowlpox virus，F(xiàn)PV）疫苗株FPV282E4為載體，以EGFP為標(biāo)記基因，采用挑斑方法篩選重組FPV，利用PCR、RT-PCR和Western印跡進(jìn)行鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析，最終獲得一株穩(wěn)定表達(dá)SIV Env蛋白的重組FPV，通過其所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可為HIV疫苗研究提供可資借鑒的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

含有SIV env基因的質(zhì)粒pVR-SIV env由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所馮霞博士惠贈(zèng)；穿梭質(zhì)粒 pTKET[14]、大腸桿菌 DH5α、FPV282E4株由本實(shí)驗(yàn)室保存；8～10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，用于制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pVR-SIV env為模板設(shè)計(jì)擴(kuò)增SIV env的引物 F（5'-GCCACCATGGGATGCCTGGGAAAC-3'，添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)及kozak序列）和R（5'-TCACTG CCTCAGCTTAGCCAG-3'，添加SalⅠ酶切位點(diǎn)）。反應(yīng)條件：94℃變性 30 s；60℃退火 30 s，72℃延伸130 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，酶切鑒定正確后進(jìn)行DNA測序。用KpnⅠ與SalⅠ雙酶切T載體上測序正確的目的基因片段，插入FPV穿梭載體pTKET的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建重組FPV質(zhì)粒pTKET-SIV env（圖1）。

1.3 FPV的重組、篩選和純化

以5MOI（感染復(fù)數(shù)）的FPV282E4感染生長至80%融合的CEF，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2～3 h，用QIAGEN公司的轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CEF中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光后，收取病變細(xì)胞并超聲波破碎，將其接種于單層CEF中培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下挑取蝕斑，經(jīng)超聲波破碎，再次接種于單層CEF中，重復(fù)上述操作，待形成的細(xì)胞病變處無非綠色熒光病變細(xì)胞時(shí)，挑取噬斑進(jìn)行擴(kuò)增、鑒定。

1.4 重組FPV的整合與轉(zhuǎn)錄

將純化的重組FPV以5MOI接種CEF，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，提取感染細(xì)胞的總基因組和RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以基因組和cDNA為模板，擴(kuò)增SIV env、FPV-P4b（上游引物為5'-GGACGCGTATTGATTCACACCGTATTA CAGAGG-3'，下游引物為5'-CGCCCGGGTTCTCC TAATAAGTTACACCGTTTG-3'）、FPV-TK（上游引物為5'-GGACGCGTCAGCAGGTGCTAAACAACAA-3'，下游引物為5'-GGCTGCAGCGGTAGCTTAACG CCGAATA-3'）基因。反應(yīng)條件：94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸130 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。TK基因作為VAVC的一個(gè)常用插入位點(diǎn)，也用于FPV和其他禽痘病毒的重組位點(diǎn)[15-16]，因此選取TK基因作為重組FPV是否篩純的鑒定指標(biāo)。P4b基因存在于所有FPV中，通常將其用于FPV的特異性鑒定[17]。

1.5 重組FPV表達(dá)產(chǎn)物的檢測

將純化的重組FPV以5MOI接種CEF，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，用裂解緩沖液RIPA裂解細(xì)胞，離心取上清，加入5×SDS-PAGE緩沖液，沸水浴10 min，經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到Im?mun-Blot PVDF 膜上，以兔抗 gp120/160（Mac293）（購自Eneyme公司）和鼠抗GAPDH抗體（購自碧云天公司）為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（購自中杉金橋公司）和辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（購自中杉金橋公司）為二抗進(jìn)行抗體結(jié)合反應(yīng)，利用ECL方法進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，設(shè)立GAPDH為內(nèi)參。

圖1 重組雞痘病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

1.6 遺傳穩(wěn)定性分析

將篩選純化的重組FPV在CEF中連續(xù)傳代20次，分別選取傳代次數(shù)為1、5、10、15、20的感染病毒的細(xì)胞，觀察熒光并提取其基因組、總RNA和總蛋白，利用PCR、RT-PCR、Western印跡檢測SIV env基因在重組FPV中的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 重組FPV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

將純化的重組FPV以5 MOI接種BHK21細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞能否表達(dá)熒光。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

按照前述方法擴(kuò)增SIV env基因，可獲得2.1 kb左右的目的片段，將其分別連接到pMD18-T載體中，經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，可切出2.1 kb左右的目的片段，表明擴(kuò)增成功。經(jīng)測序證明為目的基因序列（圖略）。

2.2 重組FPV穿梭質(zhì)粒pTKET-SIV env酶切鑒定

重組FPV穿梭質(zhì)粒pTKET-SIV env經(jīng)KpnⅠ和SalⅠ酶切，可看到2.1 kb左右的目的片段及4.8 kb左右的載體片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 重組FPV的整合與轉(zhuǎn)錄鑒定結(jié)果

提取重組FPV感染CEF的基因組和總RNA，進(jìn)行PCR和RT-PCR，結(jié)果見圖3，重組FPV基因組和cDNA均可擴(kuò)增出SIV env片段（2160 bp）、P4b片段（578 bp），證明目的基因已整合到重組FPV中并能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。由圖3還可以看出，重組FPV基因組未擴(kuò)增TK基因，而野生型毒株可以擴(kuò)增出TK特異性條帶，說明重組FPV已經(jīng)獲得純化。

2.4 重組FPV表達(dá)產(chǎn)物的檢測結(jié)果

將重組FPV感染CEF的裂解液行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜后，分別與兔抗gp120/160、鼠抗GAPDH抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG反應(yīng)，用ECL方法進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果見圖4。重組病毒感染的細(xì)胞可檢測出相對(duì)分子質(zhì)量約120×103的SIV Env目的條帶，而野生型FPV感染檢測為陰性，用GAPDH抗體檢測可見相對(duì)分子質(zhì)量約40×103的目的條帶，表明目的蛋白成功表達(dá)且具有抗原性。

2.5 遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果

將經(jīng)挑斑純化的重組FPV連續(xù)傳代20次，分別取第1、5、10、15、20代病毒觀察，可見每代均有熒光（圖5）；提取基因組和總RNA進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測SIV env基因，結(jié)果表明各代重組FPV均能擴(kuò)增出2160 bp的目的片段（圖6）；同時(shí)制備蛋白樣品進(jìn)行Western印跡，可見相對(duì)分子質(zhì)量約120×103的特異性蛋白條帶，而FPV檢測為陰性（圖7）。表明重組FPV傳代20次內(nèi)具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.6 重組FPV在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況

為了驗(yàn)證本研究構(gòu)建的重組FPV能否在哺乳動(dòng)物中表達(dá)外源蛋白，以5MOI病毒量感染BHK21細(xì)胞，72 h后觀察，可以看到感染重組病毒的細(xì)胞有大量熒光表達(dá)，而感染野生毒株的對(duì)照細(xì)胞則無（圖8），表明重組FPV能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。

3 討論

圖2 重組穿梭質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 重組FPV的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖4 重組FPV表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡鑒定

艾滋病在1981年突然出現(xiàn)，并在極短的時(shí)間內(nèi)迅速蔓延，至今已造成約6000萬人感染，而且新感染者人數(shù)正以每年260萬持續(xù)增長[18]。艾滋病已成為世界上最具破壞性的傳染病之一，雖然各國都在盡力研究抗艾滋病藥物，企圖阻止病毒在不同感染階段時(shí)的復(fù)制，但由于HIV基因在治療期間的突變，使得藥物往往無法達(dá)到理想的治療效果。因此，研制安全和有效的疫苗，是控制、消除艾滋病流行的主要措施，近年來研究者已逐步開始關(guān)注以病毒為載體的HIV疫苗。

FPV載體是應(yīng)用較為廣泛的禽痘病毒。鑒于禽痘病毒具有嚴(yán)格的胞漿復(fù)制、忠實(shí)表達(dá)外源蛋白、自然條件下只感染禽類、流產(chǎn)性感染哺乳動(dòng)物且不產(chǎn)生感染性子代病毒粒子等特點(diǎn)，且其具有很大的外源基因容量，構(gòu)建相對(duì)容易，因此以FPV為載體的重組疫苗已經(jīng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和禽類的研究中[19-22]。

SIV與HIV具有很高的同源性。由于SIV的遺傳結(jié)構(gòu)和生物特性與HIV非常相似，同時(shí)SIV獼猴動(dòng)物模型與HIV患者有許多相似之處[23]，主要表現(xiàn)為身體消瘦、機(jī)會(huì)性感染及CD4+T淋巴細(xì)胞大量丟失，因此，SIV感染模型在目前最適于艾滋病發(fā)病機(jī)制及疫苗戰(zhàn)略研究[24]。

圖5 不同代次重組FPV的熒光分析

逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜糖蛋白在感染初期發(fā)揮著重要的作用，它涉及結(jié)合細(xì)胞膜和細(xì)胞表面受體使病毒融合進(jìn)入細(xì)胞；在感染后期，Env在病毒裝配的過程中也扮演重要角色，有證據(jù)表明包膜基質(zhì)蛋白與Env在細(xì)胞內(nèi)相互作用直接影響病毒粒子在極化上皮細(xì)胞的釋放位置[25-26]，位于胞內(nèi)區(qū)的Env能夠相互作用，同時(shí)還會(huì)影響Env的摻入和感染力。此外，去除細(xì)胞質(zhì)域能夠增加被感染細(xì)胞表面Env的表達(dá)量和摻入病毒樣顆粒以及Env融合活性[27]，同時(shí)Env還具備良好的免疫原性，能夠有效刺激SIV特異性IFN-γ分泌細(xì)胞的產(chǎn)生和誘導(dǎo)較高水平的Env特異性反應(yīng)[28]，能夠產(chǎn)生高濃度的特異性抗體[29]，能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)[30]。因此，Env作為有效抗原被廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)以SIV env為抗原基因，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)Env蛋白的重組FPV，并采用挑取噬斑的方法進(jìn)行篩選，同時(shí)以EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因，使重組FPV在感染CEF后能特異性表達(dá)綠色熒光蛋白，由此大大提高重組病毒的檢出率，又可避免用BrdU加壓篩選導(dǎo)致基因突變的不利影響。用PCR、RT-PCT、Western印跡對(duì)重組FPV進(jìn)行了鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析，表明我們構(gòu)建的重組FPV能同時(shí)表達(dá)SIV Gag和SIV Env，具備更廣泛的免疫原性，且重組FPV能在BHK21細(xì)胞中大量表達(dá)，為其在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用及HIV疫苗研究提供了可資借鑒的數(shù)據(jù)。

圖6 不同代次重組FPV的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖7 不同代次重組FPV表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡

圖8 重組FPV在BHK21細(xì)胞中的表達(dá)

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