葉晨陽，徐建明，林莉，王巖，葛飛嬌，趙傳華，李珊珊，付亞莉，李志強

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院消化腫瘤科，北京 100071

人MDM2（murine double minute 2）基因定位于12號染色體，廣泛表達于人體的多個器官，在骨骼肌中的含量最高，其次為肝、肺、胰等，與細胞基本生理活動有關(guān)。MDM2蛋白包含5個保守區(qū)，從N端開始，分別為Ⅰ區(qū)（19～102氨基酸殘基，是MDM2與p53相互結(jié)合部位）、Ⅱ區(qū)（181～185殘基，為核定位序列）、Ⅲ區(qū)（221～272殘基，是含有40%谷氨酸和精氨酸殘基的高度酸性區(qū)域，能與核糖體L5蛋白及5S rRNA結(jié)合）、Ⅳ區(qū)（305～322殘基，含有1個鋅指結(jié)構(gòu)）和Ⅴ區(qū)（438～478殘基，含有1個環(huán)指結(jié)構(gòu)，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，也可以與DNA或RNA結(jié)合）[1]。MDM2具有泛素化連接酶的功能，已報道的MDM2蛋白最重要的功能是與p53蛋白直接結(jié)合形成p53-MDM2復(fù)合物，介導(dǎo)p53通過泛素-蛋白酶體途徑降解，從而抑制p53的功能[2-4]。MDM2在細胞中的其他功能研究相對較少。

我們擬構(gòu)建MDM2真核表達載體，并驗證其與p53的相互作用，為進一步研究MDM2蛋白在細胞內(nèi)的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞購自ATCC；pcDNA3.0-Flag載體購自Invitrogen公司；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PCR試劑購自TaKaRa公司；DMEM、小牛血清購自Gibco公司；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Pro?mega公司；測序由華大生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 Flag-MDM2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以人乳腺文庫為模板，PCR擴增MDM2基因的CDS序列。正向引物為5'-CGCGGATCCATGGTGA GGAGCAGGCAAATGTG-3'，反向引物為5'-CGG AATTCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAAT-3'。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，以95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.5 min行30個循環(huán)，72℃延長7 min。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pcDNA3.0-Flag載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，形成帶有粘性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pcDNA3.0-Flag載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆進行測序。

1.3 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

將293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時細胞密度達到80%為宜，24 h后進行轉(zhuǎn)染。將4 μL VigoFect與 200 μL NaCl混合，再將總量為 5 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，24 h后收集細胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心5min，取上清液進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的Flag抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫共沉淀

轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，用0.5 mL IP緩沖液裂解細胞，冰浴30 min；超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，留30 μL做Input；取一定量的偶聯(lián)抗體的磁珠，用IP緩沖液平衡3次，每次10 min；取30 μL磁珠加到細胞裂解物中，4℃結(jié)合4 h；用0.5 mL IP緩沖液洗滌沉淀物4次，每次10 min；沉淀加入30 μL 2×SDS蛋白加樣緩沖液，煮沸10 min變性，進行SDS-PAGE；用抗另一種蛋白的抗體進行Western印跡分析，檢測2種蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

2 結(jié)果

2.1 Flag-MDM2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以人乳腺文庫為模板，PCR擴增人MDM2的編碼序列，獲得長1494 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后與同樣經(jīng)這2種酶切的pcDNA3.0-Flag載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進行菌液PCR鑒定，所得的陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1494 bp的條帶，5000 bp條帶為pcDNA3.0-Flag載體，1494 bp條帶為MDM2，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。序列測定結(jié)果表明，插入載體的DNA序列與人MDM2基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.2 Flag-MDM2在293T細胞中的表達

將構(gòu)建的Flag-MDM2重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后收細胞，提取蛋白進行SDSPAGE，Western印跡檢測構(gòu)建的Flag-MDM2是否表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Flag-MDM2的細胞裂解物能在相對分子質(zhì)量約60×103處檢測到明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的細胞裂解物無條帶（圖3），說明Flag-MDM2重組蛋白在293T細胞中能夠成功表達。

2.3 Flag-MDM2與p53存在相互作用

文獻報道MDM2能夠結(jié)合并降解p53，因此，我們利用免疫共沉淀實驗驗證了構(gòu)建的帶Flag標(biāo)簽的MDM2與帶Myc標(biāo)簽的p53的相互作用，結(jié)果如圖4，在細胞內(nèi)p53可以和MDM2結(jié)合，而不能與陰性對照Flag空載體結(jié)合，說明MDM2與p53存在特異的相互作用，與文獻報道一致。

圖1 PCR擴增人MDM2的編碼序列

圖2 Flag-MDM2的BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測Flag-MDM2的表達

圖4 Flag-MDM2與p53存在相互作用

3 討論

我們擴增了人MDM2基因，并連接到帶有Flag標(biāo)簽的真核表達載體上，經(jīng)過酶切和測序鑒定克隆構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293T細胞證明Flag-MDM2基因成功表達。根據(jù)文獻報道，利用免疫共沉淀實驗驗證了Flag-MDM2與p53的相互作用，證明Flag-MDM2載體表達的蛋白具有生物學(xué)功能。

MDM2蛋白由497個氨基酸殘基構(gòu)成，在膠質(zhì)母細胞瘤[5]、脂肪肉瘤[6]、黑色素瘤[7]、乳腺癌[8]、食道癌[9]、骨肉瘤[10]、結(jié)直腸癌[11-12]等多種腫瘤中過量表達。研究表明，MDM2在腫瘤中發(fā)揮癌基因的功能，MDM2的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗證實MDM2會誘導(dǎo)小鼠腫瘤的發(fā)生[13-14]。p53是目前研究最深入的抑癌基因，廣泛參與細胞凋亡、細胞周期、基因組穩(wěn)定性等腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。MDM2癌基因功能的發(fā)揮主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解抑癌基因p53，抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[15]。MDM2在腫瘤中的其他功能及分子機制研究較少，我們構(gòu)建的Flag-MDM2真核表達載體將為探討MDM2的其他功能奠定基礎(chǔ)。

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