劉羽，高麗華，邵勇，王友亮，胡顯文，陳惠鵬

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

腫瘤內(nèi)皮標志物8（tumor endothelial marker 8，TEM8）又稱炭疽毒素受體1（anthrax toxin receptor 1，ANTXR1），是Ⅰ型跨膜蛋白，其確切的生理學功能還未知。TEM8蛋白共有3個變體，最長變體TEM8同型物（isoform）Ⅰ是由564個氨基酸殘基構成的單次跨膜糖蛋白，具有較長的富集脯氨酸的胞質(zhì)尾部，相對分子質(zhì)量約為（80～85）×103，包括胞外vWA結構域和一個巨大的胞質(zhì)尾部[1]。體外研究表明，TEM8在多種內(nèi)皮細胞功能中具有重要作用，其胞外區(qū)能結合細胞外基質(zhì)蛋白，同樣也能結合炭疽毒素保護性抗原。臨床樣本研究表明TEM8在腫瘤內(nèi)皮細胞中過表達，而在正常成熟組織中表達零星不規(guī)則且遠遠低于腫瘤內(nèi)皮組織[2]。這些發(fā)現(xiàn)均暗示了在成熟細胞內(nèi)TEM8高表達往往是由于異常的脈管生成，如腫瘤脈管系統(tǒng)，即可以將TEM8作為靶向腫瘤內(nèi)皮組織的治療靶點。

TEM8作為炭疽毒素受體，介導炭疽毒素進入宿主細胞。但在沒有炭疽毒素存在的情況下，TEM8在細胞中的生理功能尚不清楚。在本研究中，我們構建了pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP真核表達載體，并穩(wěn)定轉染HEK293F細胞，以此得到穩(wěn)定表達TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F細胞系，為后期實驗研究奠定了良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞HEK293F由本實驗室貯存；大腸桿菌Trans10感受態(tài)細胞購自全式金公司；真核表達載體pcDNA3.1（+）-EGFP由本研究室構建；編碼TEM8基因所需質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8由本實驗室構建；Taq DNA聚合酶購自奧賽博公司；DNA限制性內(nèi)切酶、快速連接酶均購自NEB公司；質(zhì)粒小量制備盒及DNA膠回收試劑盒為天根公司產(chǎn)品；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；新生胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；G418、轉染試劑LipofectAMINE 2000均購自Life Technologies公司。

1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的構建

以質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8為模板PCR擴增得到TEM8基因序列全長（1668 bp，優(yōu)化后）。上游引物為T8up1（5'-CCCAAGCTTACCATGCGGG CACTGCTGGCCAGACTGCTGCTGTGCGTGCTGGTG-3'，含HindⅢ酶切位點）、T8up2（5'-GCTGCTGTGC GTGCTGGTGGTGTCTGACAGTAAAGGGGGCGGAA GGCGAGAAGAC-3'），下游引物為 T8down（5'-CGC GGATCCCTTGGCCTTGGAGGGGGTC-3'，含 BamHⅠ酶切位點）（引物由Life Technologies公司合成）。首先用上游引物T8up2和下游引物T8down以質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8為模板進行PCR反應擴增，以回收后的產(chǎn)物為模板，采用上游引物T8up1和下游引物T8down再次進行PCR反應擴增，凝膠回收得到TEM8基因。將TEM8基因和 pcDNA3.1（+）-EGFP載體分別以HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后連接并轉化大腸桿菌Trans10感受態(tài)細胞后，將其均勻接種在含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基中過夜培育，選取PCR驗證陽性的菌落進行測序。

1.3 細胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉染

HEK293F細胞以1×105/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 48 h；用 Lipo?fectAMINE 2000轉染試劑將pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP質(zhì)粒轉染HEK293F細胞，用含0.5 mg/L G418、8%FBS的DMEM選擇性培養(yǎng)基加壓篩選，采用有限稀釋法制備單克隆細胞，最終得到穩(wěn)定表達TEM8蛋白的單克隆細胞系TEM8-EGFP/HEK293。

1.4 細胞表達蛋白的鑒定

過表達TEM8的TEM8-EGFP/HEK293細胞及HEK293細胞生長至密度約90%時裂解細胞，裂解液于95℃變性5 min，并等量上樣，經(jīng)SDS-PAGE后恒壓電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶1000稀釋的抗TEM8抗體ab21270，于靜音混合器上37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用辣根過氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗1∶5000稀釋，37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，室溫避光顯色5 min，壓片顯影。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的構建、酶切鑒定及DNA序列測定

經(jīng)2步PCR擴增獲得目的基因TEM8（圖1）。經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切及連接轉化，得到含有目的基因的重組質(zhì)粒，酶切鑒定證明重組質(zhì)粒攜帶目的基因（圖2），測序結果顯示pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重組質(zhì)粒序列無誤（圖3為質(zhì)粒示意圖）。

2.2 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP在HEK293F細胞中的表達

pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP轉染陽性細胞經(jīng)G418加壓篩選和有限稀釋克隆，在96孔板中形成多個單克隆并標記。將陽性克隆于24孔板、6孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶中逐級擴大培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達，最終得到穩(wěn)定表達TEM8蛋白的陽性細胞系（圖4）。

2.3 細胞的蛋白表達鑒定

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的PCR擴增結果

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的酶切鑒定

為驗證陽性細胞系所表達的新生蛋白是否為目的基因的表達產(chǎn)物，選擇綠色熒光較強的2株陽性單克隆細胞系 TEM8-EGFP/HEK293F（1）、TEM8-EGFP/HEK293F（5）進行Western印跡，結果如圖5，在相應位置出現(xiàn)2條條帶，相對分子質(zhì)量約為85×103，證明陽性細胞系表達TEM8蛋白。

3 討論

近年來，靶向破壞腫瘤脈管系統(tǒng)在腫瘤生物學和治療學領域受到眾多研究者的關注。腫瘤血管化提供腫瘤持續(xù)發(fā)生發(fā)展所必需的氧及營養(yǎng)物質(zhì)[3]。腫瘤通過血管獲得潛在的遷移能力，并且由此能夠緩解其無限增殖導致的低氧環(huán)境。若這種血管發(fā)生受到抑制或改變，則腫瘤無法從新生脈管系統(tǒng)中得到營養(yǎng)供給，這些腫瘤組織將會饑餓而死。因此，靶向脈管生成而治療腫瘤的發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要。同時這些脈管網(wǎng)絡受腫瘤微環(huán)境影響，導致多種蛋白表達改變，應該存在一種新的因子能夠破壞或阻斷腫瘤血管的生長[4]。經(jīng)過一系列分子技術探究，得到一些集中過表達的蛋白，其中較為特別的就是腫瘤內(nèi)皮標志物8，其在多種腫瘤脈管中高表達，并且在種屬間高度保守[5]。

圖3 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重組質(zhì)粒圖譜

圖4 穩(wěn)定表達TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F細胞系

圖5 Western印跡檢測2株TEM8-EGFP/HEK293F單克隆細胞系中TEM8的表達

TEM8同型物Ⅰ具有結合胞外基質(zhì)的胞外區(qū)及富含Cys的胞質(zhì)尾部。其胞外區(qū)主要由包含一個金屬離子結合位點（MIDAS）的vWA結構域組成，與整合素的結構域Ⅰ有很高的同源性。體外研究發(fā)現(xiàn)TEM8在多種內(nèi)皮細胞中具有一定作用[6]，且其胞外區(qū)能結合胞外基質(zhì)蛋白[7]及炭疽毒素保護性抗原[8]。已有研究表明，TEM8具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移[9]、黏附[10]及腫瘤血管生成的功能[11]。有部分研究表明，TEM8具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移和黏附的功能。

我們構建、表達了TEM8同型物Ⅰ與EGFP的融合蛋白，目的在于進一步研究TEM8的正常生理功能及其在腫瘤血管形成中的機制。EGFP的表達可以快速并準確地顯示TEM8在細胞內(nèi)的表達及定位，大大縮短了篩選TEM8蛋白表達陽性細胞系的時間，并可以進一步通過活細胞工作站直接觀測不同細胞因子刺激下TEM8在細胞中的定位。實驗結果證明真核載體轉染后能使低表達TEM8的HEK293F細胞顯著表達TEM8蛋白。以上結果為進一步研究TEM8的生理功能等奠定了基礎。

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