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        球毛殼菌降解天然木質(zhì)纖維素能力差異及酶系基因分析

        2014-10-27 09:04:28郝曉冉牛學(xué)良李強潘皎朱旭東
        生物技術(shù)通訊 2014年1期
        關(guān)鍵詞:株菌木質(zhì)木質(zhì)素

        郝曉冉,牛學(xué)良,李強,潘皎,朱旭東

        1.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京 100875;2.南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300071

        木質(zhì)纖維素是植物體利用太陽能合成的常見的可再生高能聚合物,主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,是地球上分布最廣泛、含量最為豐富的生物質(zhì)[1]。將木質(zhì)纖維素酶解為單糖,在生物燃料及生物材料行業(yè)有很好的應(yīng)用前景,對于減緩全球變暖、能源危機和環(huán)境污染具有十分重要的意義。木質(zhì)纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的主要工藝流程包括:預(yù)處理分離木質(zhì)素,將纖維素和半纖維素暴露出來;酶解纖維素和半纖維素;微生物發(fā)酵單糖物質(zhì)合成乙醇[2]。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜,往往需要通過預(yù)處理才可以使得多糖物質(zhì)降解為可發(fā)酵單糖。傳統(tǒng)的物理化學(xué)預(yù)處理方法條件要求嚴格、能耗大、成本高,新型的生物預(yù)處理方法不僅摒棄了上述缺陷,而且溫和環(huán)保,因此受到越來越多的關(guān)注。新方法主要利用自然界中廣泛存在的微生物(主要是白腐真菌、木腐真菌、放線菌和細菌等[2-3]),通過分泌漆酶(laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)、錳過氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)等攻擊、解聚生物質(zhì)中的木質(zhì)素以達到預(yù)處理的效果[2]。生物預(yù)處理還被應(yīng)用于造紙行業(yè)中,不僅可大大提高紙張的亮度和張力,而且還節(jié)省了37%~47%的能耗[4]。高效降解木質(zhì)纖維素的白腐真菌還曾被用來對木質(zhì)纖維素物質(zhì)的生物降解[5]及對環(huán)境的生物修復(fù)[6-7]。木質(zhì)纖維素材料中的纖維素成分的生物降解至少需要3類酶的參與,即內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,EG,水解β-1,4糖苷鍵)、外切葡聚糖酶(exoglucanase)[包括β-1,4-D-葡聚糖水解酶(1,4-β-D-glucan glucano?hydrolase)和纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH),作用于纖維素線狀分子的末端,連續(xù)水解β-1,4糖苷鍵,生成纖維二糖或葡萄糖分子]和β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase,BGL,可將纖維糊精或纖維二糖水解成葡萄糖分子[8])。此外,纖維二糖脫氫酶(cellobiose dehydrogenase,CDH)和糖苷水解酶(glu?coside hydrolase,GH)等協(xié)同作用,還可促進纖維素的酶解糖化[9]。半纖維素的主要成分是木聚糖,通過木聚糖酶(xylanases)加以分解,包括內(nèi)切木聚糖酶(endoxylanases)、β-木聚糖苷酶(β-xylosidase)、木聚糖乙酰酯酶(xylan acetyl esterase)和α-葡萄糖醛酸酶(α-glucuronidase)[10]。

        毛殼屬(Chaetomium)真菌是一類分布僅次于青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)的常見真菌[11],在分解利用植物體及其他纖維素物質(zhì)的過程中起重要作用。迄今,陸續(xù)從該屬真菌中分離鑒定出內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、熱穩(wěn)定性纖維二糖水解酶、纖維二糖脫氫酶、木聚糖酶等一系列參與纖維素半纖維素降解的酶[12-16]。該屬的某些種類如嗜熱毛殼菌(C.thermophilium)還能夠分泌漆酶[17]。毛殼屬的常見種類球毛殼菌(C.globosum)廣泛分布于土壤、堆肥、植物種子、鹽沼、木材及含纖維素的制品中,研究者發(fā)現(xiàn)球毛殼菌還具有分解棉纖維、麥秸稈、咖啡豆及油棕櫚樹葉的作用[18-20]。由于球毛殼菌在生長過程中能產(chǎn)生球毛殼甲素(chaetoglobosin A,ChA)等具有抗癌抗線蟲活性的多種次級代謝產(chǎn)物[21-23],目前的研究熱點主要集中于球毛殼菌次級代謝產(chǎn)物方面,而有關(guān)球毛殼菌降解木質(zhì)纖維素的報道還很少。我們從自然界中分離篩選出4株能分解利用木質(zhì)纖維素的內(nèi)共生真菌,通過18S rDNA及形態(tài)學(xué)特征分析將其鑒定為球毛殼菌,并將4株菌培養(yǎng)在分別以微晶纖維素、楊樹葉和木屑為惟一碳源的培養(yǎng)基上,比較分析球毛殼菌菌株間木質(zhì)纖維素酶活力差異及球毛殼甲素合成情況。結(jié)合已測序成功的球毛殼菌CBS148.51的基因組信息,對球毛殼菌基因組中分布的木質(zhì)纖維素降解酶類進行了歸類分析,為球毛殼菌木質(zhì)纖維素降解過程的研究及該菌種的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        球毛殼菌NK102(柏樹)、NK103(日本油松)、NK104(紅皮云杉)、NK105(水杉)為本實驗室自行分離的植物內(nèi)共生真菌,純化的菌株在土豆培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)上于28℃連續(xù)培養(yǎng)7 d,用于后續(xù)試驗。用于木質(zhì)纖維素酶活力檢測及發(fā)酵合成ChA的3種基物培養(yǎng)基參考Umikalsom等報道的配方[18],1 L培養(yǎng)基中包括2 g KH2PO4、0.3 g Mg?SO4·7H2O、0.2 g CaCl2·2H2O、2 mg CoCl2、1.6 mg MnSO4·H2O、1.4 mg ZnSO4·H2O、2 mL Tween-80、1 mL微量元素溶液[1 g/L FeSO4·7H2O,1 g/L Mn?SO4·H2O,0.25 g/L Na2MoO4·2H2O,0.1 g/L H3BO4,0.25 g/L CuCl2· 2H2O,0.25 g/L ZnCl2,0.1 g/L NH4NO3,0.25 g/L Co(NO3)2·6H2O,0.1 g/L NiSO4·6H2O,5 mL/L H2SO4]、9 g KNO3,以及10 g基物碳源[微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、楊樹葉(Populus sp.leaves)或木屑(wood powder)]。

        1.2 真菌鑒定

        各菌株接種于PDA平板上,于28℃培養(yǎng)數(shù)天,觀察菌落形態(tài);連續(xù)培養(yǎng)7 d后收集菌絲、孢子并涂布于載玻片上進行顯微觀察。參照Raeder等[24]的方法提取各菌株的基因組DNA,以UK4F(5'-CYGGTT?GATCCTGCCRG-3')、UREV(5'-GYTACCTTGTTAC?GACTT-3')[25]為引物進行PCR反應(yīng),擴增各菌株的18S rDNA序列,并將目的片段交華大基因公司進行測序,將測序結(jié)果上傳至GenBank,利用NCBI Blast在數(shù)據(jù)庫中對測序結(jié)果進行匹配,用CLUSTAL_X2軟件對各序列及與其同源性較高的序列進行Align?ment,用MEGA4.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

        1.3 木質(zhì)纖維素利用能力檢測

        用菌種尖端接種法分別接種菌絲塊于羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose,CMC)和纖維素剛果紅(cellulose-Congo red agar)[26]平板,檢測菌株的纖維素降解能力。木質(zhì)素降解能力的檢測在Bavendamm平板上進行,具有木質(zhì)素降解能力的真菌在生長過程中可分泌木質(zhì)素降解酶類(漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶),能使愈創(chuàng)木酚等化合物聚合,在菌落周圍形成紅棕色輪環(huán),呈陽性反應(yīng),不能利用木質(zhì)素、僅利用纖維素的菌株呈陰性反應(yīng)。記錄菌落生長直徑d1和變色圈直徑d2,計算d1/d2,比較各菌株的木質(zhì)素降解能力。

        1.4 酶活力檢測

        用菌絲尖端接種法分別將各菌株接種于含200 mL液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,30℃恒溫振蕩(120 r/min)連續(xù)培養(yǎng)4 d,發(fā)酵產(chǎn)物于4500 r/min離心5 min,上清液作為粗酶液進行后續(xù)反應(yīng)。

        纖維素酶活力通過降解纖維素物質(zhì)產(chǎn)生的還原糖量來測定。酶解反應(yīng)于0.1 mol/L、pH4.8的醋酸鹽緩沖液中進行,于50℃水浴中反應(yīng)30 min。1個酶活力單位(U)定義為酶促反應(yīng)中每分鐘生成1 μmol葡萄糖(還原糖)所需的酶量[27]。漆酶活力通過氧化2,2'-azmobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulpho?nate)(ABTS)來測定[28]。

        1.5 HPLC檢測發(fā)酵液中的ChA

        用菌絲尖端接種法分別將各菌株接種于含200 mL液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,28℃恒溫振蕩(120 r/min)連續(xù)培養(yǎng)12 d,用布氏漏斗分離菌絲和發(fā)酵液。發(fā)酵液用等體積的氯仿/甲醇(10∶1)萃取,有機相于45℃低壓旋蒸濃縮至干,甲醇重懸沉淀物,混合均勻后12 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測(C18 ODS柱,4.6 mm×250 mm;柱溫箱調(diào)節(jié)為30℃,流動相為70%甲醇水溶液,流速1 mL/min,檢測波長227 nm)。

        2 結(jié)果

        2.1 NK103、NK104和NK105菌種鑒定及與NK102親緣關(guān)系分析

        NK103、NK104和NK105于PDA培養(yǎng)基上生長良好,28℃培養(yǎng)4 d,肉眼觀察4株菌形態(tài)相似,菌落初期為白色,后為棕褐色,菌落背面呈圓環(huán)狀;菌絲有色,分支有隔;子囊孢子為單細胞、檸檬狀、深褐色;子囊殼球形,孔口有深褐色的緣絲。NK102的形態(tài)學(xué)特征見圖1。

        利用真菌18S rDNA通用引物分別擴增NK103、NK104和NK105的18S rDNA序列,測序后將序列上傳至GenBank,登錄號分別為JN394588、JN639019和JN639021。通過NCBI Blast,發(fā)現(xiàn)這3株菌與球毛殼菌18S rDNA序列(GenBank:AB048285)的同源性均最高,達99%。結(jié)合NK102的18S rDNA序列(HQ529774),利用鄰接法構(gòu)建了這4株菌的系統(tǒng)進化樹(圖2),表明NK102、NK103、NK104、NK105與球毛殼菌、Humicola grisea var.grisea都處于同一生態(tài)位分支上。鑒于上述4株菌的形態(tài)學(xué)特征與球毛殼菌更為相近,確定該4株菌為球毛殼菌。并且,NK104與NK105的親緣關(guān)系最為接近;NK103與NK102的親緣關(guān)系接近,與NK104、NK105的親緣關(guān)系相對較遠。

        2.2 NK102、NK103、NK104和NK105的木質(zhì)纖維素降解能力差異

        采用CMC培養(yǎng)基、纖維素剛果紅培養(yǎng)基及常用的Baverndamm變色反應(yīng)對NK102、NK103、NK104和NK105的木質(zhì)纖維素降解能力進行比較,結(jié)果如圖3。4株菌在CMC平板上生長旺盛,28℃培養(yǎng)4 d后菌落直徑可達30~75 mm,革蘭氏碘液(Gram's io?dine)[26]浸泡后形成明顯的水解圈,直徑約3.0~3.2 cm,菌株間差異不顯著。4株菌生長在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)4 d后菌落變紅,在菌落周圍形成可見的水解圈,直徑依次為1.8、1.4、1.9和1.9 cm。NK103所形成的水解圈略小,推測其在這4株菌中降解羧甲基纖維素的能力稍弱。NK102、NK103、NK104和NK105在Bavendamm變色反應(yīng)實驗中都呈陽性反應(yīng)。在Bavendamm培養(yǎng)基Ⅰ上生長良好,并且與愈創(chuàng)木酚發(fā)生反應(yīng)形成紅棕色變色圈。在Bavendamm培養(yǎng)基Ⅱ上生長緩慢,28℃培養(yǎng)15 d后都能形成棕色圈,變色圈直徑d2明顯大于菌落直徑d1。根據(jù)d1/d2,這4株菌降解木質(zhì)素的能力由強到弱依次為NK103、NK102、NK105、NK104。

        2.3 NK102、NK103、NK104和NK105的木質(zhì)纖維素酶和漆酶酶活力比較

        為初步比較球毛殼菌NK102、NK103、NK104和NK105在分解利用天然木質(zhì)纖維素材料過程中纖維素酶和漆酶的表達情況,我們將這4株菌分別接種于以微晶纖維素、楊樹葉和木屑為惟一基物碳源的液體培養(yǎng)基中,于30℃培養(yǎng)箱中120 r/min連續(xù)培養(yǎng)4 d后取樣,直接檢測發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶和漆酶的酶活力。培養(yǎng)物目測發(fā)現(xiàn),4株菌都可以有效分解利用微晶纖維素,并在培養(yǎng)5~7 d時分解完全,但所產(chǎn)生的纖維素酶活力都低于或等于0.1 U/mL發(fā)酵液,遠遠低于利用其他2種基物碳源產(chǎn)生的纖維素酶活力。如圖4A所示,NK102、NK103、NK104和NK105在以楊樹葉為基物碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的纖維素酶活力依次為0.35、0.26、0.18和0.20 U/mL,是以微晶纖維素為基物碳源時的2~4倍。4株菌在以木屑為惟一碳源的培養(yǎng)基中生長非常緩慢,添加氮源蛋白胨之后,菌絲生長旺盛,纖維素酶活力大大提高,依次為0.76、0.70、0.73和0.66 U/mL,是以微晶纖維素為基物碳源時的6~19倍。4株真菌中以NK102分泌的纖維素酶活力最高,可達0.76 U/mL發(fā)酵液。我們還檢測了發(fā)酵液中漆酶的酶活力,各菌株的漆酶活力較低,以反應(yīng)液吸光度值與對照吸光度值的差來表示各菌株的漆酶活力大小。如圖4B所示,在以微晶纖維素為唯一碳源時,4株菌都能分泌漆酶,但差異顯著,NK103的漆酶活力最高,這一結(jié)果與平板試驗一致。在以楊樹葉為唯一碳源底物時,NK103的漆酶活力升高,而其他3株菌的漆酶活力下降甚至為零。在添加蛋白胨的木屑培養(yǎng)基中,各菌株都不分泌漆酶,說明蛋白胨成分對漆酶產(chǎn)生抑制作用,僅提供碳源促進球毛殼菌的生長。

        2.4 NK102、NK103、NK104和NK105合成ChA的能力差異

        前期工作發(fā)現(xiàn)NK102、NK103、NK104和NK105在生長過程中都能夠合成ChA。為檢測4株菌在分解利用微晶纖維素、楊樹葉及木屑等基物時ChA的合成情況,分別接種 NK102、NK103、NK104和NK105于上述3種基物碳源培養(yǎng)基中,在28℃培養(yǎng)箱中以120 r/min的轉(zhuǎn)速連續(xù)培養(yǎng)12 d取樣,發(fā)酵產(chǎn)物萃取純化后進行HPLC檢測。依照ChA回歸曲線,通過峰面積計算發(fā)酵液中的ChA含量。結(jié)果如圖5,4株菌在3種基物培養(yǎng)基上生長都能合成ChA,但ChA產(chǎn)量受到基物碳源的影響。在木屑培養(yǎng)基中,4株菌雖然生長良好,但HPLC檢測到的發(fā)酵產(chǎn)物量都很低,ChA合成量均≤1.0 mg/L。NK102、NK103、NK104、NK105在3種基物碳源培養(yǎng)基中生長所合成的ChA量都遠遠低于生長在PDA培養(yǎng)基中所得的量。NK102在微晶纖維素液體培養(yǎng)基生長12 d后ChA合成量為4.47 mg/L發(fā)酵液,在楊樹葉液體培養(yǎng)基中,其ChA產(chǎn)量是微晶纖維素的2倍。球毛殼菌合成ChA的能力還表現(xiàn)出菌株間的差異。NK103在微晶纖維素培養(yǎng)基中合成的ChA更多(5.11 mg/L發(fā)酵液),是楊樹葉培養(yǎng)基中的3.6倍,與NK102不同。另外,NK104和NK105無論是培養(yǎng)在以微晶纖維素還是木屑為惟一碳源的培養(yǎng)基中,其ChA產(chǎn)量均≤1.0 mg/L,變化不大,但在以楊樹葉為惟一碳源時,ChA產(chǎn)量大大升高至原來的20倍左右(≥11 mg/L)??偟膩碚f,3種基物碳源中,楊樹葉最適合培養(yǎng)球毛殼菌合成ChA。

        2.5 球毛殼菌CBS148.51基因組中木質(zhì)纖維素降解酶基因的分布

        纖維素酶多為糖蛋白,酶分子的一級結(jié)構(gòu)由核心催化域(catalytic domain,CD)、碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域1(carbohydrate binding domain 1,CBM1)和將這2部分相連的鏈接區(qū)(linker)組成。CBM1的氨基酸序列高度保守[29],不僅在纖維素酶中存在,在降解半纖維素和其他一些細胞壁結(jié)構(gòu)成分的酶中也發(fā)揮功能[30]。Longoni[31]以真菌 CBM1(Cdd:smart00236)為參考序列,在球毛殼菌CBS148.51基因組中尋找到30個纖維素代謝相關(guān)基因;以糖水解酶GH7保守的催化結(jié)構(gòu)域(Cdd:cd07999)為參考序列,在球毛殼菌基因組中找到7個可能編碼GH7的基因。他們沒有對編碼參與半纖維素和木質(zhì)素降解的酶的基因進行歸納,并且尋找到的參與纖維素降解的酶也不完善。鑒于此,我們在其工作基礎(chǔ)上,以CAZy數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org/)中可能參與纖維素降解的GH家族蛋白的氨基酸序列作為參考序列,通過IMGBlastp(E值<1e-5)對球毛殼菌CBS148.51基因組中可能編碼纖維素半纖維素降解酶的基因進行了歸納。同時,以黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chryso?sporium)的纖維二糖脫氫酶(cellobiose dehydroge?nase,CDH)基因(GenBank:Q01738.1)為參考序列,在球毛殼菌CBS148.51基因組中找到11個同源相關(guān)序列。以白腐真菌變色栓菌(Trametes versicolor)漆酶基因(GenBank:BAA23284.1)和粗糙脈孢菌(Neu?rospora crassa)漆酶基因(GenBank:AAA33592.1)為參考序列,通過NCBI blastp在球毛殼菌CBS148.51基因組中尋找編碼漆酶的基因。

        如表1所示,球毛殼菌CBS148.51基因組中分布有119個纖維素半纖維素酶降解相關(guān)基因。其中有54個可能編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因(GH5、GH6、GH7、GH12、GH45、GH51、GH61家族)、8個可能編碼外切葡聚糖酶的基因(GH7家族)、1個可能編碼β-葡聚糖苷酶的基因(GH1家族)、11個可能編碼纖維二糖脫氫酶的基因、18個可能編碼β-木糖苷酶的基因(GH3和GH43家族)、7個可能編碼內(nèi)切木聚糖酶的基因(GH10家族)、12個可能編碼木聚糖酶的基因(GH11、XynB)、1個可能編碼木聚糖乙酰酯酶的基因、1個可能編碼α-葡萄糖醛酸酶的基因。也就是說,球毛殼菌CBS148.51擁有完整的降解纖維素半纖維素酶系。此外,CBS148.51基因組中還分布有8個可能編碼漆酶的基因,分別為CHGG_00543、CHGG_02290、CHGG_03552、CHGG_06172、CHGG_08215、CHGG_08781、CHGG_10025和CHGG_11082。參考黃孢原毛平革菌編碼錳過氧化物酶的序列(GenBank:AAA33743.1),在CBS148.51基因組中找到2個(CHGG_01567和CHGG_02518)可能編碼MnP的基因。沒有找到可能編碼木質(zhì)素過氧化物酶的基因。上述基因組學(xué)基礎(chǔ)表明球毛殼菌具有分解利用木質(zhì)纖維素的能力,在開發(fā)真菌分解利用木質(zhì)纖維素的進程中具有舉足輕重的地位。

        表1 球毛殼菌CBS148.51基因組木質(zhì)纖維素降解酶類基因功能預(yù)測

        3 討論

        木質(zhì)纖維素降解為小分子單糖的過程非常復(fù)雜,至少需要幾十種酶協(xié)同作用才能破壞植物細胞壁的復(fù)雜結(jié)構(gòu),降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。白腐真菌因具有能徹底降解木質(zhì)素的功能[32],在自然界能有效降解木質(zhì)纖維素的微生物中研究得最為深入。土壤、空氣和植物體內(nèi)廣泛存在的球毛殼菌在生長過程中可產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物,如具有殺線蟲、抗癌抗真菌活性的ChA[21-22],近年來引起研究者廣泛的關(guān)注。除了作為重要的生防真菌,球毛殼菌在生態(tài)系統(tǒng)中還扮演著分解者的角色,具有分解利用木質(zhì)纖維素的能力[18-20]。我們利用已測序的球毛殼菌代表菌株CBS148.51的基因組信息,尋找到119個編碼纖維素半纖維素降解酶的基因、8個編碼漆酶的基因和2個編碼錳過氧化物酶的基因,證明球毛殼菌具有完整的纖維素半纖維素降解酶系統(tǒng)。這可為后續(xù)球毛殼菌木質(zhì)纖維素降解過程的研究及開發(fā)利用提供參考。

        本研究的另一個目的是檢測分離自不同植物體的內(nèi)共生球毛殼菌NK102、NK103、NK104、NK105的木質(zhì)纖維素降解能力,并進一步研究不同菌株間的差異。本研究用到的碳源基物楊樹葉為作者校園中的普通行道和綠化樹種,在我國北方十分常見,秋季落葉處理是很大的問題。另外一種基質(zhì)木屑來自普通的家具廠,也是需要處理的富含木質(zhì)纖維素的廢棄物。我們將分離到的4株球毛殼菌進行了初步分類,對其利用纖維木質(zhì)素的能力進行了分析,發(fā)現(xiàn)它們都能很好地以微晶纖維素(純纖維素)為惟一碳源,特別是在不加碳氮源的楊樹葉和木屑培養(yǎng)基上,這4株菌均能生長,在楊樹葉培養(yǎng)基上生長良好,能夠?qū)⑼暾臉淙~基質(zhì)完全降解(目測消失),說明球毛殼菌可獨自處理楊樹葉。而木屑(我們并未有意限定木質(zhì)種類,僅為了觀察這些菌降解木質(zhì)纖維素的一般能力)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)春?,菌株的降解能力大大提高,這可能是因為木屑中的氮源含量較低。我們還比較了NK102、NK103、NK104和NK105發(fā)酵粗酶液中纖維素酶和漆酶的分泌情況。這4株菌可以分泌纖維素酶和漆酶,酶活力受到碳源的影響;蛋白胨的添加可大大提高纖維素酶活力,但不會誘導(dǎo)漆酶的合成。以微晶纖維素為碳源時,4株菌都產(chǎn)漆酶,產(chǎn)量有所不同;而以木屑為碳源時,即使添加漆酶最適氮源蛋白胨,在4株菌的培養(yǎng)液中也幾乎都檢測不到漆酶;菌株間的差異比營養(yǎng)條件對漆酶合成的影響更大。針對所測的3種碳源,NK103在4株菌中漆酶的合成量始終最高,在木質(zhì)素利用方面有很大的潛力。同時,由于球毛殼菌可分泌熱穩(wěn)定性木聚糖酶及大量的β-葡糖苷酶,在分解利用纖維素方面優(yōu)于瑞氏木霉(Trichoderma reesei)[33]。因此,球毛殼菌可作為利用天然木質(zhì)纖維素等植物生物質(zhì),開發(fā)有用產(chǎn)品的良好基盤生物。同時具有分解木質(zhì)素和纖維素能力的微生物并不多見,球毛殼菌具有這種特性,因而這類真菌用來開發(fā)降解農(nóng)業(yè)、環(huán)境中廢棄纖維木質(zhì)素物質(zhì)具有一定的優(yōu)勢。

        前期工作首次發(fā)現(xiàn)ChA具有高效殺死根結(jié)線蟲的作用,因為ChA是穩(wěn)定的天然產(chǎn)物,開發(fā)成為抗線蟲的農(nóng)用化合物有自身優(yōu)點,使得利用球毛殼菌防治線蟲成為可能。高效液相色譜分析顯示,4株菌在分解利用微晶纖維素、楊樹葉和木屑的過程中都能夠穩(wěn)定合成ChA,值得一提的是,NK104在以楊樹葉為基質(zhì)時產(chǎn)生的ChA最高,達到14.88 mg/L。各菌株在3種碳源基物培養(yǎng)基上生長,其ChA合成能力受到碳源的影響,菌株間表現(xiàn)出顯著差異,與親緣關(guān)系有關(guān)。如親緣關(guān)系近的NK104和NK105在微晶纖維素和木屑培養(yǎng)基中都只能合成微量ChA(≤1.0 mg/L),但培養(yǎng)在楊樹葉培養(yǎng)基中時,ChA產(chǎn)量大幅增長,達11 mg/L以上。這個結(jié)果表明,利用自然界中大量存在的廢棄物木質(zhì)纖維素生物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)天然生防制劑ChA,不僅可以大大節(jié)省成本,對于解決三農(nóng)問題,減少環(huán)境污染也是完全可能的。

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