薛永常，蔡宏明，李 根

(大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧 大連 116034)

放線菌是生理活性物質尤其是天然藥物的重要來源。海洋放線菌因其在高鹽、高壓、低溫、低氧、低光照和寡營養(yǎng)的選擇壓力下可能會調整其次生代謝途徑，從而產生并積累具有特殊化學結構和生物活性的功能物質，成為研究抗生素的重點來源菌株，1998年以來從海洋放線菌中發(fā)現的新藥數量連年均超過了陸地放線菌［1-3］。在抗生素生物合成途徑中，鹵化酶催化的鹵化作用起著重要的作用［4-6］，而放線菌的次生代謝產物的鹵化更極大提高了代謝產物的抑菌活性，此鹵化過程常常是通過依賴FADH2的鹵化酶催化［7］。第一個鹵化酶是從卡爾里霉素的產生菌Caldariomyces fumago中發(fā)現的，此后又陸續(xù)發(fā)現分離到了其他一些含血紅素的氯化、溴化和碘化過氧化酶［8］。研究發(fā)現，海洋鏈霉菌產生的鹵化酶具有催化次生代謝物鹵化的遺傳和生理潛力［9-10］，因此從海洋鏈霉菌中篩選FADH2依賴性鹵化酶基因，對于探討鹵化酶的催化機理具有重要的意義。本文是在前期已對大連海域海洋放線菌多樣性及分類鑒定［11］進行探討的基礎上，從分離鑒定的鏈霉菌Streptomyces sp.B-17基因組 DNA中擴增出FADH2依賴性鹵化酶基因片段，并分析其生物信息學特征，以期對海洋鏈霉菌的綜合利用及鹵化藥物的基因定向篩選提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用鏈霉菌 自大連海域海泥中分離純化，并經16S rDNA鑒定的菌株Streptomyces sp.B-17［11］。

1.1.2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)購自北京百泰克生物技術有限公司，超薄瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒(離心柱型)、DNA Marker、dNTP、Taq DNA polymerase、X-Gal、IPTG 和Amp購自天根科技(北京)有限公司，pMD-19T載體、內切酶Hind III、Cla I購自寶生物(大連)生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及鹵化酶基因的PCR擴增 鏈霉菌基因組DNA提取按細菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)方法。鹵化酶擴增引物采用Hornung［12］等設計的色氨酸-7-鹵代酶特異引物 P1和 P2:引物:P1:5'-TTCCCSCGSTACCASATTCGGSGAG-3'，P2:5'-GSGGGATSWMCCAGWACCASCC-3'。PCR擴增體系:PCR反應體系為10 × Taq reaction buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1 μL，P1、P2(10 μmol/L)各 0.7 μL，基因組 DNA 1 μL，Taq DNA polymerase(2.5 U/μL)0.4 μL，ddH2O補足20 μL;其擴增條件:預變性95℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火57℃ 45 s，延伸72℃90 s，共35個循環(huán);擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果。

1.2.2 PCR產物的回收及目的片段與pMD-19T載體的連接及轉化 PCR產物回收按照超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)說明書進行。與pMD-19T載體的連接參考T載體說明書，大腸埃希菌感受態(tài)細胞制備及質粒轉化參考文獻［13］。

1.2.3 重組質粒的鑒定及序列分析 利用特異引物對重組質粒進行擴增，同時利用pMD-19T載體克隆位點兩側的Hind III、Cla I對重組質粒進行雙酶切鑒定并測序。應用ClustalX 2.0、DNAMAN、MEGA4.1等在線分析工具和軟件分析目的片段的序列，進行比對分析和構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 目的片段的PCR擴增及其鑒定

以P1、P2為引物，B-17菌的基因組 DNA為模板進行梯度PCR，以確定最適退火溫度，結果見圖1。從圖1可以看出，3號和10號泳道在約600 bp處擴增出較清晰整齊的條帶，其大小與預期目的片段一致，因此選擇56℃為最佳退火溫度，經優(yōu)化最終PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，見圖2。

回收約500 bp左右的目的擴增片段，與pMD-19T載體進行連接，轉化大腸埃希菌JM109感受態(tài)細胞，在含有X-Gal、Amp和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，篩選白色單菌落提取質粒進行電泳，在約3 kb處有1條清晰整齊的DNA條帶，為重組質粒DNA的電泳條帶;重組質粒經特異引物擴增(圖3)及Hind III/Cla I雙酶切鑒定(圖4)，證明插入到pMD-19T載體的DNA為目的片段，將所得質粒進行測序鑒定。

圖1 B-17基因組DNA的PCR退火溫度優(yōu)化的電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of optimization of PCR annealing temperature of DNA extracted from B-17

圖2 擴增DNA片段電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of amplified DNA fragment from B-17 Genomic DNA

圖3 重組質粒的PCR擴增圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of amplified fragment from the recombinant plasmid DNA

圖4 重組質粒的酶切電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid DNA cut by Hind III and Cla I

2.2 目的片段的生物信息學分析

重組質粒測序結果表明該擴增片段大小為524 bp，與預期片段大小一致，且正向插入到pMD-19T載體，證明是插入片段為目的 DNA片段。

應用Clustal X 2.0軟件將該序列與從NCBI數據庫中已登陸的11個鹵代酶基因進行同源性比對，并用MEGA4.1采用鄰接法(NJ法)構建進化樹(圖5)。結果顯示，所得序列的同源性與一種未鑒定菌種U.microorgainism擬表達鹵代酶序列較為相近。

將克隆片段序列利用NCBI在線工具nucleotide blast進行同源序列搜索，結果發(fā)現克隆片段與Actinocorallia herbida DSM 44252依賴FADH2的2個鹵化酶基因的同源性為88%(圖6)，與Clum，A等(2010)發(fā)表的 Pirellula staleyi DMD 6068編碼色氨酸鹵化酶基因序列(CP001848)的相似性也達到74%，證明所克隆的基因片段為鹵化酶基因片段。

圖5 目的基因序列與其他鹵代酶基因的NJ進化樹分析Fig.5 NJ phylogenetic tree based on the relationship of target gene sequence with other halogenase generated by MEGA4.1 program

圖6 序列在BLAST的比對結果部分圖Fig.6 Part result of sequences in the BLAST

利用NCBI在線ORF fider軟件，對克隆片段核苷酸序列進行分析，將DNA序列翻譯為氨基酸序列，其編碼的氨基酸序列為:

將該片段擬表達的氨基酸序列與模板序列進行同源性比較，結果見圖7。在163個氨基酸中有116個相同，同源性達到71%。

圖7 克隆的鹵代酶基因擬表達氨基酸序列比對Fig.7 Alignment of predict halogenase amino acid sequence with the sequences from tryptophan halogenase

3 討論

從核苷酸序列和氨基酸序列的比對及同源性分析可以看出，本研究所克隆的序列和已發(fā)現的鹵代酶序列有極高的同源性，蛋白質比對重復性也達到了71%，所以本實驗中從B-17基因組內克隆到的基因片段可初步斷定為鹵代酶基因片段，為后續(xù)的基因功能分析及表達奠定了基礎。但是此結果與高鵬等［9］分離得到的大多鹵化酶在氨基酸序列上與已知鹵化酶明顯不同的實驗結果不一致，因此需要研究更多的實驗材料才能得出統(tǒng)計學數據。同時，海洋放線菌作為未來重要的抗生素產生來源菌，其產生的鹵化酶又具有催化產生新的鹵代產物的潛力，從海洋放線菌可能更容易分離到新的鹵代化合物，這就為新的生理活性物質的篩選提出了新的方向。

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