祁贊梅，楊 冀，韓 雪，張婭琳，趙國明，曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

瘧疾是嚴重威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾?。?］。在瘧原蟲誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，前炎癥反應(yīng)與抗炎因素的平衡是清除寄生蟲感染并避免產(chǎn)生病理反應(yīng)的重要基礎(chǔ)［2-3］。白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是建立這種平衡過程中具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵細胞因子［3］。大量臨床研究顯示，瘧疾所導(dǎo)致的嚴重貧血與患者血漿中較低的IL-10水平有關(guān)，而高原蟲血癥及部分腦瘧患者具有較高的血漿IL-10水平［4-8］。因此，IL-10水平異常與瘧疾臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，了解瘧疾免疫應(yīng)答過程中IL-10的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機制對于研究瘧疾免疫應(yīng)答調(diào)控以及預(yù)防和治療臨床并發(fā)癥具有重要意義。2002年Bhan及其同事［9］首次證實產(chǎn)生IL-10的B細胞能夠抑制炎癥反應(yīng)，并將其稱為調(diào)節(jié)性 B細胞(regulatory T cells，Bregs)。Bregs的關(guān)鍵特性是產(chǎn)生IL-10，尚未發(fā)現(xiàn)Bregs獨有的表面分子或標志性轉(zhuǎn)錄因子，其分化來源和機制也未闡明［10］。Bregs的主要生物學(xué)作用包括，通過與T細胞的同源相互作用和釋放IL-10抑制Th1和Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［10-11］;參與維持Tregs的數(shù)量和功能［11］;分化為產(chǎn)生抗體的漿細胞［12］。Bregs的上述生物學(xué)作用使其在自身免疫性疾病、移植、腫瘤和部分感染性疾病中的作用逐漸受到重視，但目前對Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答中的作用尚缺少了解。本研究利用P.c AS感染的小鼠模型，觀察了瘧疾免疫應(yīng)答過程中Bregs數(shù)量變化和表型特點，以期探討B(tài)regs在瘧疾免疫調(diào)節(jié)中的作用地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及瘧原蟲感染模型 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)經(jīng)腹腔感染1×106P.c As寄生的紅細胞(Parasitized Red Blood Cell，pRBC)，感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率。

1.1.2 主要儀器及試劑 流式細胞儀(FACS Calibur，BI);CD16/32 封閉抗體(93 克隆)、抗CDld-FITC單抗(1B1克隆)、抗 IL-10-PE單抗(JES5-16E3克隆)、抗CD19-PE/cy5單抗(6D5克隆)、抗 CD5-APC 單抗(53-7.3克隆)、抗 CD4-APC單抗(GK1.5克隆)及其相關(guān)熒光標記同種型對照購于Biolegend公司;固定透膜液(Fixation and Permeabilization Solution)購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量 RT-PCR 在感染后第0、3、5、8天處死小鼠，取少量脾組織，使用Trizol試劑提取總RNA，按PrimeScript RT Reagent Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。取100 ng RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR Premix Ex Ta試劑盒說明書配制20 μL PCR體系，于Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Australia)實時定量PCR儀中進行擴增。熱循環(huán)過程:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。使用核糖體 S17蛋白(RPS17)作為內(nèi)參，利用兩倍系列稀釋樣品制作標準曲線。使用的特異性引物序列如下:RPS17 F:5'-TGTCGGGATCCACCTCAATG-3';RPS17R:5'-CGCCATTATCCCCAGCAAG-3';IFN-γ F:5'-AAAGACAATCAGGCCATCAG-3';IFN-γ R:5'-TGGGTTGTTGACCTCAAACT-3';IL-10F:5'-CAGTACAGCCGGGAAGACA-3';IL-10 R:5'-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3'。

1.2.2 流式細胞儀檢測 感染后第0、3、5、8天取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。脾細胞在添加PMA(50 ng/mL)、LPS(10 μg/mL)、Ionomycin(1 μg/mL)及 Monensin(20 μmol/L)的含 10%胎牛血清 (FCS)的RPMII 1640刺激培養(yǎng)5 h。取1×106脾細胞，用含2%BSA的PBS洗滌后，加入FcR III/II封閉20 min，然后加入特異性熒光抗體或相應(yīng)同種型對照抗體進行多重表面染色。在表面染色后，固定透膜，加入抗IL-10單抗進行細胞內(nèi)細胞因子染色。用固定透膜液充分洗滌后，重懸于0.5 mL 1%多聚甲醛中。流式細胞儀進行檢測，使用WINMID2.9軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件，t檢驗比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P﹤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.c AS感染后小鼠紅細胞感染率和脾細胞因子 IL-10、IFN-γmRNA 水平變化

P.c AS感染小鼠于感染后第5天在外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細胞，隨后，原蟲血癥水平持續(xù)升高，于感染后第9天達到30%左右，并出現(xiàn)大量死亡，在感染后第10天全部死亡;脾組織細胞因子IL-10 mRNA水平在感染后第3天明顯升高，在感染后第5天達到高峰，此后緩慢下降，感染后第8天仍為未感染小鼠的10倍左右。IFN-γ mRNA水平在感染后3～5 d有小幅上升，約為未感染小鼠的5倍左右，感染后第8天恢復(fù)到正常水平。

圖1 BALB/c小鼠感染P.c AS后的原蟲血癥水平(A)和脾細胞因子IL-10、IFN-γ mRNA水平(B)變化Fig.1 The changes of parasitaemia(A)and the splenic mRNA levels of IL-10、IFN-γ(B)of BALB/c mice infected with P.c AS

2.2 P.c AS 感染后脾細胞中 CD19+IL-10+、CD4+IL-10+細胞百分比和絕對數(shù)量比較

P.c AS感染后第3天，脾中CD19+細胞和CD4+細胞中IL-10+細胞百分比均出現(xiàn)有意義的升高。CD4+細胞中IL-10+細胞百分比在感染后第5天達到高峰，約占CD4+細胞的15%，感染后第8天回落至正常水平附近;CD19+細胞中IL-10+細胞百分比在感染后持續(xù)上升，至感染后第8天達到5%左右，未見回落趨勢。CD19+IL-10+、CD4+IL-10+細胞絕對數(shù)量變化趨勢與百分比變化趨勢相似，感染后第5天內(nèi)CD4+IL-10+細胞絕對數(shù)量高于CD19+IL-10+細胞數(shù)量，但感染后第8天，CD19+IL-10+細胞數(shù)量達到CD4+IL-10+細胞數(shù)的5倍左右。

圖2 BALB/c小鼠感染P.c AS后脾內(nèi)CD4+和CD19+細胞中IL-10+細胞百分比變化(A)和絕對數(shù)量比較(B)Fig.2 The changes of the persentage of IL-10+cells in the splenic CD4+and CD19+cells and(A)the comparasion of their absolute numbers(B)in P.c AS-infected BALB/c mice

2.3 CD19+IL-10+Bregs表型分析

P.c AS感染后第8天，脾細胞中IL-10+細胞約占脾細胞總數(shù)的2%，其中80%以上為CD4－CD19loBregs細胞。對CD19loIL-10+Breg表面CD5和CD1d的分析顯示，約90%的CD19loIL-10+Bregs為CD5－細胞，其中一半以上為CD1d+細胞。

圖3 P.c AS感染后第8天BALB/c小鼠脾內(nèi)IL-10+細胞表面分子的表達分析Fig.3 The expression of surface molecules on IL-10+cells in the spleen from BALB/c mice at day 8 post P.c AS infection

3 討論

由于IL-10來源復(fù)雜，作用多樣，目前對IL-10在瘧疾免疫應(yīng)答中的活化及其調(diào)節(jié)機制知之甚少。能夠產(chǎn)生IL-10的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)曾被認為在瘧疾免疫調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色，但研究顯示，Tregs只能部分地抑制保護性Th1應(yīng)答，并且在抑制免疫病理損傷方面的作用有限［13-14］。另有研究顯示，約氏瘧原蟲感染的小鼠模型中，IL-10在Tregs的免疫調(diào)節(jié)功能中并不起主要作用［15］。

本研究顯示，P.c AS感染后脾組織 IL-10 mRNA水平隨原蟲血癥的升高而不斷上升，在感染初期的0～5 d內(nèi)，T細胞是IL-10的主要來源，但其后，CD19+B細胞取代T細胞成為主要的IL-10產(chǎn)生細胞。在約氏瘧原蟲感染的小鼠中也觀察到類似的結(jié)果。由此可知，Bregs在鼠瘧模型中大量活化，是感染中后期IL-10的主要來源，但是此前Bregs的作用一直沒有得到足夠認識。Bao等［16］在反復(fù)藥物治愈的對腦瘧有抵抗作用的小鼠中發(fā)現(xiàn)，感染后第7天，血漿IL-10水平顯著高于對照組，顯著增高的IL-10+淋巴細胞亞群是CD19+細胞，被動轉(zhuǎn)移脾CD19+B細胞可保護小鼠不發(fā)生腦瘧。Liu等［17］的研究也顯示過繼轉(zhuǎn)移Bregs而非Tregs對腦瘧的發(fā)生有抑制作用。這些結(jié)果都顯示，Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答過程中可能發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。

目前研究較多的小鼠脾中Bregs為B10細胞，其較為公認的表型為 CD19+CD5+CD1dhi［9］。雖然有研究顯示伯氏瘧原蟲感染過程中有B10細胞的擴增［17］，但 Bao 等［16］的研究顯示反復(fù)藥物治愈的伯氏瘧原蟲感染小鼠中，高水平血漿IL-10的主要來源是CD5－CD19+細胞。本研究也顯示，夏氏瘧原蟲感染后第8天脾中分泌IL-10細胞主要為CD5－Bregs。這些結(jié)果提示，瘧疾模型中Bregs的表型和功能具有特殊性，有必要進行更深入研究。

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