李 巖，呂昌龍，桑力軒，吳素琴，王美惠，楊芳莉，孫 遜，王大南*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001;2.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫與微生物教研室，遼寧 沈陽 110101;3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001)

大蒜素具有抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老、抗微生物、抗?jié)?、提高機體免疫力等多種藥理作用［1-2］。體內(nèi)外實驗證明，大蒜素對多種微生物及寄生蟲有強大的抑制和殺滅作用，被稱為植物廣譜抗菌素。大蒜素抗菌譜廣，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、葡球菌、鏈球菌、克雷白桿菌、變形菌、梭狀桿菌均有明顯抑制作用［3］。黑大蒜是一種新型大蒜加工產(chǎn)品，由新鮮大蒜經(jīng)過一定的溫度和濕度處理而制成，與新鮮大蒜相比，其S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)含量明顯升高，且無刺激性氣味，可直接食用。佐佐木的研究表明黑大蒜除具有明顯的抗氧化和抗腫瘤作用外，也具有抗細菌和抗真菌作用［4］。本文就黑大蒜提取物與抗生素聯(lián)合應(yīng)用是否可降低抗生素對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抗菌作用的使用量進行了體外研究，獲得如下結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923，大腸埃希菌ATCC 25922購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 藥品 頭孢唑林標準品(Cefazolin，200 mg/支，中國藥品生物制品檢定所，純度:99.3%，批號:0421-9603);慶大霉素標準品(Gentamicin，200 mg/支，中國食品藥品檢定研究所，純度:95.1%，批號:130326-201015);黑大蒜由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授提供。

1.1.3 培養(yǎng)基與儀器 MH肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司);比濁儀(法國生物梅里埃公司);連續(xù)微量加樣器(美國Eppendorf公司);八導(dǎo)微量加樣器(美國Eppendorf公司);96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液配制 從已分純的待檢細菌平板上挑取4～5個菌落，接種于3～5 mL MH肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)6 h。菌液用MH肉湯混勻后經(jīng)比濁儀校正濁度至0.5麥氏比濁標準，再用MH肉湯稀釋至1.5×105cfu/mL備用。

1.2.2 抗菌藥物儲備液配制 頭孢唑林用pH 6.0、0.1 mol/L的PBS緩沖液配制成終濃度為2048 mg/L的儲備液，并稀釋成1000 μg/mL的工作液;慶大霉素用蒸餾水配制成終濃度為2048 mg/L的儲備液，并稀釋成1000 μg/mL的工作液。以上藥物經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌后備用。

1.2.3 黑大蒜提取物溶液配制 將100 g黑大蒜搗碎后，置1.5 L去離子水中煮沸2 h，待冷卻后8000 r/min，4℃離心30 min，取上清液再次離心，將上清液轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，用真空冷凍干燥機制備干粉。將干粉用蒸餾水配制成1000 μg/mL的工作液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過除菌后備用。

1.2.4 液體稀釋法 參照2009年CLSI推薦的液體稀釋法進行抗菌藥物敏感試驗。將各抗菌藥物原液(1000 μg/mL)5.12 mL 加入 4.88 mL MH 肉湯中，混勻。吸出并分別加入第1管和第2管，每管1 mL，第2管經(jīng)混合后吸出1 mL加入第3管，依次類推至第15管后，吸出1 mL棄去，即各管最終的藥物含量依次為 512、256、…、0.03 μg/mL。另設(shè)MH肉湯培養(yǎng)基對照和待測菌生長對照。接下來，將已校正濃度的菌液依次加入各管中，每管0.05 mL，混勻，于37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 液體稀釋法藥敏結(jié)果判斷標準 結(jié)果參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)中液體稀釋法的判定標準，肉眼未見細菌生長的藥物最低濃度即為該待測菌最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌時間-殺菌曲線的測定 取培養(yǎng)18 h的細菌分別接種于5 mL含不同濃度黑大蒜提取物的MH肉湯中，使細菌終濃度為1.5×105cfu/mL。黑大蒜提取物濃度分別為 MIC/4、MIC/2、MIC、4MIC。細菌生長對照管加入相應(yīng)體積的MH肉湯，空白對照管加入黑大蒜提取物但不加細菌。于37℃恒溫搖床培養(yǎng)(120 r/min)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 取培養(yǎng)液，在紫外分光光度計600 nm下測定OD值，以時間為橫坐標，OD600為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.7 聯(lián)合藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法，菌液配制與黑大蒜提取物溶液配制同上。將黑大蒜提取物溶液以MH肉湯倍比稀釋成10個濃度，分別為 1000、512、…、2 μg/mL。將頭孢唑林和慶大霉素分別用MH肉湯倍比稀釋成10個濃度，即為 16、8、…、0.03 μg/mL。將配好的不同濃度的黑大蒜提取物溶液與頭孢唑林或慶大霉素按棋盤法設(shè)計，兩兩組合加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每種藥物加入50 μL，再將已校正濃度的菌液100 μL加入孔中，37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.8 聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果判斷 記錄單獨應(yīng)用兩藥的最低抑菌濃度MIC甲藥單用和乙藥單用，并選擇最佳組合效應(yīng)時兩藥聯(lián)合時各自的MIC甲藥聯(lián)用和乙藥聯(lián)用，以計算FIC指數(shù)。

FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用

FIC 指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用

0.5 ＜FIC指數(shù)≤1，相加作用

1＜FIC指數(shù)≤2，無關(guān)作用

FIC指數(shù)＞2，拮抗作用

2 結(jié)果與分析

2.1 黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果

以頭孢唑林對金黃色葡萄球菌的抑菌效果作對照，即頭孢唑林對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25 μg/mL(臨床推薦劑量內(nèi))，黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的MIC值為256 μg/mL。

2.2 黑大蒜提取物對大腸埃希菌的MIC測定結(jié)果

以慶大霉素對大腸埃希菌的抑菌效果作對照，即慶大霉素對大腸埃希菌的MIC值為0.25 μg/mL(臨床推薦劑量內(nèi))，黑大蒜提取物對大腸埃希菌的MIC值為256 μg/mL。

2.3 黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的時間-殺菌曲線

結(jié)果如圖1所示，不加藥物的金黃色葡萄球菌對照的吸光度直線上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度顯著下降，細菌生長受到明顯抑制。當加入濃度為MIC的黑大蒜提取物時，吸光度緩慢增長，說明細菌生長受到抑制。當達到培養(yǎng)16 h時，出現(xiàn)最低抑菌時間點，之后吸光度又有所升高。當加入濃度為4MIC的黑大蒜提取物時，吸光度一直處于最初水平，說明此濃度細菌生長受到顯著抑制。結(jié)果證明黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用呈現(xiàn)較強的濃度依賴性。

圖1 不同濃度黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Staphylococcus aureus

2.4 黑大蒜提取物對大腸埃希菌的時間-殺菌曲線

結(jié)果如圖2所示，不加藥物的金黃色葡萄球菌對照的吸光度直線上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度顯著下降，細菌生長受到明顯抑制。當加入濃度為MIC的黑大蒜提取物時，吸光度增長緩慢且接近最初值，說明細菌數(shù)量增長緩慢。當加入濃度為4MIC的黑大蒜提取物時，吸光度一直處于較低水平，說明細菌生長受到顯著抑制。黑大蒜提取物對大腸埃希菌的體外抑菌作用呈現(xiàn)較強的濃度依賴性。

圖2 不同濃度黑大蒜提取物對大腸埃希菌的時間-殺菌曲線Fig.2 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Escherichia coli

2.5 黑大蒜提取物與頭孢唑林聯(lián)用對金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果

黑大蒜提取物聯(lián)合頭孢唑林對金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果見表1，F(xiàn)IC指數(shù)為0.75，結(jié)果顯示黑大蒜提取物聯(lián)合頭孢唑林對金黃色葡萄球菌的抗菌作用表現(xiàn)為相加作用。

表1 黑大蒜提取物與頭孢唑林聯(lián)用對金黃色葡萄球菌的MIC(μg/mL)Table 1 Table1 The MIC of black garlic extracts combined with Cefazolin against Staphylococcus aureus(μg/mL)

2.6 黑大蒜提取物與慶大霉素聯(lián)用對大腸埃希菌的MIC測定結(jié)果

黑大蒜提取物聯(lián)合慶大霉素對大腸埃希菌的MIC測定結(jié)果見表2，F(xiàn)IC指數(shù)為0.5，結(jié)果顯示黑大蒜提取物聯(lián)合慶大霉素對大腸埃希菌的抗菌作用表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表2 黑大蒜提取物與慶大霉素聯(lián)用對大腸埃希菌的MIC(μg/mL)Table 2 The MIC of black garlic extracts combined with Gentamicin against Escherichia coli(μg/mL)

3 討論

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是醫(yī)院感染的常見病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，葡萄球菌屬尤其是MRSA的檢出率和耐藥率有逐年增加的趨勢，而耐藥大腸埃希菌的檢出率也在逐年攀升，這成為臨床面臨的非常棘手的難題［5］。單獨使用一種抗菌藥物對嚴重的細菌感染作用有限，并易誘導(dǎo)細菌耐藥性，因此臨床上越來越傾向于聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物來控制耐藥菌所致的嚴重感染?？咕幬锫?lián)合應(yīng)用的意義在于可增強抗菌藥物的協(xié)同抗菌作用，提高療效;發(fā)揮兩藥迅速而強大的殺菌作用，避免誘導(dǎo)細菌耐藥性的產(chǎn)生;并可減少毒性較大的藥物劑量，降低不良反應(yīng)［6］。因此，在新型抗菌藥物面世之前，聯(lián)合用藥成為臨床必不可少的治療手段。大蒜素作為一種天然抗菌藥物，具有一定的抑制病原菌和真菌的作用，并具有生物性能好、不良反應(yīng)小以及具有免疫調(diào)節(jié)功能等特性。其抗菌原理在于大蒜素分子中的氧原子與細菌生長繁殖所必須的半胱氨酸中的巰基結(jié)合，抑制細菌生長繁殖［7］。但多數(shù)的體外抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素MIC值較高，限制了它在抗感染治療中的應(yīng)用。已有研究報道黑大蒜較白大蒜含有更多的氨基酸、有機硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)，具有較普通大蒜更強的抗衰老、抗氧化和抗腫瘤作用［8］。本研究結(jié)果顯示，通過時間-殺菌曲線證明黑大蒜提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均呈現(xiàn)較強的濃度依賴性。黑大蒜提取物與頭孢唑林或慶大霉素聯(lián)用后抗菌效果以相加和協(xié)同效應(yīng)為主，并可顯著降低兩種抗菌藥的MIC值。黑大蒜作為天然提取物，可在很大程度上避免兩類抗菌藥物聯(lián)用后不良反應(yīng)增加的情況，同時，因黑大蒜在體內(nèi)有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，更有益于感染性疾病的治療。

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