沈文燕，李 冉，覃 揚(yáng)，楊文理，劉秋英，魏 玲，俞小琴

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，四川 成都 610041）

Vigilin（人高密度脂蛋白結(jié)合蛋白）是一個(gè)高度進(jìn)化保守的多功能蛋白質(zhì)，含有14個(gè)KH結(jié)構(gòu)域。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多KH結(jié)構(gòu)域蛋白在RNA的代謝方面起重要作用［1］。Vigilin的同源物Scp 160（酵母多KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白）和DDP1（果蠅著絲粒結(jié)合蛋白）在維持DNA、RNA的結(jié)構(gòu)和功能中均起重要作用。其中DDP1包含15個(gè)KH結(jié)構(gòu)域，它能結(jié)合單鏈核酸進(jìn)而發(fā)揮其作用［2］。DDP1參與維持DNA結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定和臂間異染色質(zhì)的形成［3］。目前已發(fā)現(xiàn)Vigilin在脂代謝以及染色體分離，mRNA代謝，轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定方面起重要作用［4～6］。Vigilin作為一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，研究其在生物體內(nèi)的作用顯得尤為重要。

慢病毒載體是在人免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV－1）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，使用慢病毒包裝系統(tǒng)建立的慢病毒能夠感染分裂細(xì)胞，終末分化細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，并能將目的基因高效的整合到宿主細(xì)胞染色體中，整合基因理論上能在細(xì)胞中永久表達(dá)。隨著慢病毒載體的逐漸改造，目前使用的慢病毒包裝系統(tǒng)包裝的慢病毒具有較高的生物安全性。慢病毒載體作為一種理想的基因轉(zhuǎn)移載體正在被越來越多的神經(jīng)科學(xué)、基因功能研究，基因表達(dá)等領(lǐng)域的科研工作者所接受［7～9］。因此，我們構(gòu)建了pCS－CG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體，包裝的重組病毒能較好的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，為后續(xù)研究在生物學(xué)形態(tài)方面vigilin功能提供了良好的生物材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胚腎細(xì)胞HEK293T，人肝癌細(xì)胞系HepG2均為本實(shí)驗(yàn)室保存。均采用含10%FBS（民海生物）的DMEM（GIBCO）培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 菌種載體及工具酶 大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；慢病毒相關(guān)載體pSPAX2，pMD2.G，pCSCG由德克薩斯州大學(xué)劉建余博士惠贈(zèng)，去除綠色熒光蛋白GFP的重組質(zhì)粒pCS－CG－vigilin為本實(shí)驗(yàn)室楊文理博士構(gòu)建；T4DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司。

1.1.3 轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺PEI購(gòu)自polysciences公司，Polybrene購(gòu)自Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。恒溫水浴箱（金壇市醫(yī)療儀器廠），恒溫?fù)u床（Beckman公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司），操凈工作臺(tái)（蘇 凈），凝膠成像儀 （Bio－Rad公司），ECLIPSE TE2000S熒光倒置顯微鏡（Nikon）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 穿梭質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2的構(gòu)建：用NheⅠ、NotⅠ將DsRed2基因目的片段從pDsRed2－N1上切下，DNA凝膠電泳回收后，用T4連接酶連入穿梭載體pcDNA3.1（－）上，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆用Nhe－Ⅰ、NotⅠ鑒定，鑒定正確后的陽性克隆送北京諾賽基因測(cè)序，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1（－）－DsRed2。重組質(zhì)粒pCS－CG－DsRed2－vigilin的構(gòu)建：將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2和pCS－CG－vigilin分別用KpnⅠ單酶切回收后連接并轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆分別用KpnⅠ和SacⅡ單酶切鑒定，酶切鑒定正確后送測(cè)序，插入了目的片段的質(zhì)粒命名為 pCS－CG－DsRed2－vigilin，重組的 pCSCG－DsRed2－vigilin部分酶切點(diǎn)圖譜見圖1。

圖1 重組慢病毒載體pCS－CG－DsRed2－vigilin圖譜Figure 1 Map of the recombinant lentiviral vector pCS－CG－DsRed2－vigilin

1.2.2 重組慢病毒包裝 分別提取慢病毒載體pCSCG、重組載體pCS－CG－DsRed2－vigilin 和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G，利用PEI共轉(zhuǎn)染入 HEK293T細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染方法為：將9μgPEI和3μg質(zhì)粒分別溶于DMEM中，其中三種質(zhì)粒的質(zhì)量比為pCS－CGDsRed2－vigilin∶pSPAX2∶pMD2.G＝4∶3∶1，室溫孵育20min后將兩者混勻，室溫孵育25min，將質(zhì)粒與PEI的混合物逐滴緩慢加于6cm培養(yǎng)皿中，6小時(shí)后更換新鮮完全培養(yǎng)基（DMEM＋10%FBS），轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集慢病毒，另加5ml新鮮完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時(shí)后收集病毒，將收集好的病毒用0.45μm的濾器過濾以除去細(xì)胞碎片，分裝，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 pCS－CG－DsRed2－vigilin載體構(gòu)建 首先在構(gòu)建的pcDNA3.1（－）－DsRed2中，挑選單克隆用 NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，挑選的6個(gè)克隆經(jīng)酶切后電泳如圖2所示，其中1、3、5、7、9、11為 NheⅠ、NotⅠ酶切產(chǎn)物，2、4、6、8、10、12為未經(jīng)酶切的相應(yīng)克隆質(zhì)粒。1、3、5、7、9、11均顯示預(yù)期的5.4kb和767bp兩條電泳條帶，送北京諾賽基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，與報(bào)道的pDsRed2—N1中DsRed2的基因序列相同。

圖2 質(zhì)粒pcDNA3.1（－）－DsRed2的鑒定Figure 2 Identification of plasmid pcDNA3.1（－）－DsRed2

已成功插入DsRed2目的片段的pcDNA3.1（－）－DsRed2中有兩個(gè) Kpn1的酶切點(diǎn)，pCS－CG－vigilin C末端緊接一個(gè)Kpn1的酶切點(diǎn)，將pcDNA3.1（－）－DsRed2、pCS－CG－vigilin分別用 Kpn1單酶切后回收連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆先用Kpn1酶切鑒定，連接上 DsRed2 的pCS－CG－DsRed2－vigilin應(yīng)有一個(gè)片段大小約800bp的insert切下，見圖3；再將帶有DsRed2insert的質(zhì)粒用SacⅡ單酶切鑒定插入的DsRed2基因的方向是正向還是反向，如果有600bp的插入子切下則DsRed2的連接方向正確，如有1400bp的insert切下則DsRed2連接方向錯(cuò)誤。正確的克隆見圖4。將酶切鑒定正確的克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié) 果 顯 示，DsRed2 已 連 到 pCS－CG－DsRed2－vigilin上，且方向正確。

2.2 重組慢病毒的包裝及鑒定 將重組表達(dá)型載體pCS－CG－DsRed2－vigilin和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24小時(shí)后收集慢病毒，再加5ml新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h收集慢病毒，過濾，分裝。將收集的慢病毒分別感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，將已經(jīng)感染的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后于熒光倒置顯微鏡下觀察紅色熒光，見圖5、6，所示較明顯的紅色熒光，說明慢病毒已成功生產(chǎn)，將同一視野自然光和熒光的圖片對(duì)比發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒可高效的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞。

圖3 pCS－CG－DsRed2－vigilin Kpn1酶切鑒定Figure 3 Identification of plasmid pCS－CG－DsRed2－vigilin by Kpn1

圖4 pCS－CG－DsRed2－vigilin SacⅡ 酶切鑒定Figure 4 Identification of plasmid pCS－CG－DsRed2－vigilin by SacⅡ

圖5 重組慢病毒感染HEK293T和HepG2細(xì)胞48h后DsRed的表達(dá)（×100）Figure 5 DsRed expression in HEK293Tcells and HepG2cells after transducing recombinant lentivirus for 48h（×100）

圖6 重組慢病毒感染HEK293T和HepG2細(xì)胞48h后DsRed的表達(dá)（×200）Figure 6 DsRed expression in HEK293Tcells and HepG2cells after transducing recombinant lentivirus for 48h（×200）

3 討論

本研究中采用慢病毒包裝體系載體pCS－CG和包裝質(zhì)粒pSPAX2，pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)成功的包裝出帶紅色報(bào)告基因的慢病毒，該包裝系統(tǒng)中pCS－CG是帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒載體骨架，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列。同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)，pSPAX2能提供gag、pol蛋白，pMD2.G提供Env蛋白。這種分工形式大大降低了恢復(fù)成野生型病毒的可能，具有較大的生物安全性。目前實(shí)驗(yàn)研究常用的病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期的細(xì)胞，且只能容納較短（＜8kb）的DNA片段。腺病毒載體雖可攜帶大片段DNA片段，但其轉(zhuǎn)、感染效率較低，只能短暫表達(dá)目的蛋白。雖然慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，但它能攜帶大片段的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上，且不易產(chǎn)生宿主免疫反應(yīng)［8～12］。故本研究采用慢病毒載體來生產(chǎn)帶有紅色熒光的vigilin慢病毒。

我們的研究將DsRed2從pDsRed2－N1中用NheⅠ、NotⅠ雙酶切切下，連入pcDNA3.1（－）上，再?gòu)膒cDNA3.1（－）－DsRed2中用Kpn1單酶切切下DsRed2片段插入 pCS－CG－vigilin中，成功構(gòu)建了pCS－CG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體。并將該重組慢病毒載體與慢病毒包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝出帶紅色報(bào)告基因的vigilin慢病毒。用該病毒分別感染HEK293T和HepG2細(xì)胞，均能觀察到較強(qiáng)的紅色熒光，說明包裝出的慢病毒能高效的感染HEK293T和HepG2細(xì)胞。這個(gè)過程中我們構(gòu)建了一個(gè)穿梭載體pcDNA3.1（－）－DsRed2，這種方法在沒有合適酶切點(diǎn)的情況下避免了采用PCR來獲取目的片段時(shí)可能發(fā)生的錯(cuò)配等情況，大大提高了構(gòu)建的效率。

4 結(jié)論

Vigilin是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，本研究構(gòu)建了pCSCG－DsRed2－vigilin重組慢病毒載體，并成功地包裝出相應(yīng)的慢病毒，包裝出的vigilin慢病毒為我們后續(xù)研究vigilin在細(xì)胞中的生物學(xué)形態(tài)奠定了基礎(chǔ)。

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