吳明健等

摘要：利用代謝組學(xué)的研究方法，對(duì)海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行篩選。運(yùn)用液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC/MSITTOF）聯(lián)用技術(shù)對(duì)海洛因檢測(cè)尿檢條陰性的16名海洛因?yàn)E用成癮者與16名正常人的血清和尿液進(jìn)行研究。多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發(fā)現(xiàn)12種可能的潛在標(biāo)志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發(fā)現(xiàn)有助于為發(fā)現(xiàn)海洛因成癮判定的潛在標(biāo)志物提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：海洛因； 代謝組學(xué)； 液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜

1引言

吸毒成癮的科學(xué)判定一直是困擾廣大緝毒及相關(guān)工作者的一大難題。近年來(lái)，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測(cè)靈敏度及借助多種先進(jìn)的分析手段來(lái)解決此難題，但均未取得突破性的進(jìn)展。代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的，是通過對(duì)分子量小于1000 Da的內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行定性與定量分析，揭示這些內(nèi)源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動(dòng)規(guī)律等的相互關(guān)系的一門新興科學(xué)[1～3]。代謝組學(xué)一經(jīng)提出，便受到廣泛關(guān)注，并已在很多領(lǐng)域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行代謝組學(xué)研究罕見報(bào)道。本研究將代謝組學(xué)的研究方法引入到毒品濫用領(lǐng)域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學(xué)研究有望將毒品鑒定的時(shí)限延長(zhǎng)，為停止吸毒一段時(shí)間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級(jí)，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實(shí)驗(yàn)室PURELAB UHQ超純水系統(tǒng)（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測(cè)試劑盒（MOR）購(gòu)自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來(lái)自16例海洛因?yàn)E用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結(jié)果與討論

3.1海洛因?yàn)E用成癮人員血清代謝組學(xué)研究多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

代謝組學(xué)研究中數(shù)據(jù)分析過程應(yīng)用的主要手段為模識(shí)別技術(shù)，包括非監(jiān)督方法和有監(jiān)督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監(jiān)督法，用于考察正常組和海洛因?yàn)E用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質(zhì)量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個(gè)參數(shù)評(píng)估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預(yù)測(cè)能力。用PCA法建模后，自動(dòng)篩選出具有代表性意義的兩個(gè)主成分，這兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數(shù)據(jù)，Q2（cum）為0.564即模型的預(yù)測(cè)能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時(shí)進(jìn)行了有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PLSDA 可以根據(jù)樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結(jié)果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因?yàn)E用成癮組內(nèi)源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預(yù)測(cè)能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數(shù)據(jù)整合起來(lái)進(jìn)行PCA建模，結(jié)果如圖5所示。模型參數(shù)R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數(shù)。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預(yù)測(cè)能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區(qū)分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結(jié)論

本研究考察了海洛因?yàn)E用成癮者血清中可能的潛在標(biāo)志物，并對(duì)尿液中的潛在標(biāo)志物也進(jìn)行了篩選。毒品尿液樣本的檢測(cè)時(shí)限一般為2～3 d，超過這個(gè)時(shí)限，現(xiàn)有檢測(cè)方法很難檢測(cè)出毒品及其中間代謝產(chǎn)物，本研究所選海洛因?yàn)E用成癮樣本均為海洛因檢測(cè)試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測(cè)的時(shí)限。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區(qū)分開，說明本方法可延長(zhǎng)毒品檢出的時(shí)限性。在發(fā)現(xiàn)海洛因?yàn)E用成癮可能的潛在標(biāo)志物方面，24種內(nèi)源性代謝物對(duì)成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了代謝組學(xué)在毒品濫用研究領(lǐng)域方面的可行性和潛在的價(jià)值，豐富了代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，為海洛因?yàn)E用成癮的科學(xué)判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112

摘要：利用代謝組學(xué)的研究方法，對(duì)海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行篩選。運(yùn)用液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC/MSITTOF）聯(lián)用技術(shù)對(duì)海洛因檢測(cè)尿檢條陰性的16名海洛因?yàn)E用成癮者與16名正常人的血清和尿液進(jìn)行研究。多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發(fā)現(xiàn)12種可能的潛在標(biāo)志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發(fā)現(xiàn)有助于為發(fā)現(xiàn)海洛因成癮判定的潛在標(biāo)志物提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：海洛因； 代謝組學(xué)； 液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜

1引言

吸毒成癮的科學(xué)判定一直是困擾廣大緝毒及相關(guān)工作者的一大難題。近年來(lái)，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測(cè)靈敏度及借助多種先進(jìn)的分析手段來(lái)解決此難題，但均未取得突破性的進(jìn)展。代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的，是通過對(duì)分子量小于1000 Da的內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行定性與定量分析，揭示這些內(nèi)源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動(dòng)規(guī)律等的相互關(guān)系的一門新興科學(xué)[1～3]。代謝組學(xué)一經(jīng)提出，便受到廣泛關(guān)注，并已在很多領(lǐng)域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行代謝組學(xué)研究罕見報(bào)道。本研究將代謝組學(xué)的研究方法引入到毒品濫用領(lǐng)域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學(xué)研究有望將毒品鑒定的時(shí)限延長(zhǎng)，為停止吸毒一段時(shí)間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級(jí)，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實(shí)驗(yàn)室PURELAB UHQ超純水系統(tǒng)（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測(cè)試劑盒（MOR）購(gòu)自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來(lái)自16例海洛因?yàn)E用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結(jié)果與討論

3.1海洛因?yàn)E用成癮人員血清代謝組學(xué)研究多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

代謝組學(xué)研究中數(shù)據(jù)分析過程應(yīng)用的主要手段為模識(shí)別技術(shù)，包括非監(jiān)督方法和有監(jiān)督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監(jiān)督法，用于考察正常組和海洛因?yàn)E用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質(zhì)量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個(gè)參數(shù)評(píng)估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預(yù)測(cè)能力。用PCA法建模后，自動(dòng)篩選出具有代表性意義的兩個(gè)主成分，這兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數(shù)據(jù)，Q2（cum）為0.564即模型的預(yù)測(cè)能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時(shí)進(jìn)行了有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PLSDA 可以根據(jù)樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結(jié)果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因?yàn)E用成癮組內(nèi)源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預(yù)測(cè)能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數(shù)據(jù)整合起來(lái)進(jìn)行PCA建模，結(jié)果如圖5所示。模型參數(shù)R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數(shù)。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預(yù)測(cè)能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區(qū)分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結(jié)論

本研究考察了海洛因?yàn)E用成癮者血清中可能的潛在標(biāo)志物，并對(duì)尿液中的潛在標(biāo)志物也進(jìn)行了篩選。毒品尿液樣本的檢測(cè)時(shí)限一般為2～3 d，超過這個(gè)時(shí)限，現(xiàn)有檢測(cè)方法很難檢測(cè)出毒品及其中間代謝產(chǎn)物，本研究所選海洛因?yàn)E用成癮樣本均為海洛因檢測(cè)試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測(cè)的時(shí)限。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區(qū)分開，說明本方法可延長(zhǎng)毒品檢出的時(shí)限性。在發(fā)現(xiàn)海洛因?yàn)E用成癮可能的潛在標(biāo)志物方面，24種內(nèi)源性代謝物對(duì)成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了代謝組學(xué)在毒品濫用研究領(lǐng)域方面的可行性和潛在的價(jià)值，豐富了代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，為海洛因?yàn)E用成癮的科學(xué)判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112

摘要：利用代謝組學(xué)的研究方法，對(duì)海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行篩選。運(yùn)用液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC/MSITTOF）聯(lián)用技術(shù)對(duì)海洛因檢測(cè)尿檢條陰性的16名海洛因?yàn)E用成癮者與16名正常人的血清和尿液進(jìn)行研究。多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發(fā)現(xiàn)12種可能的潛在標(biāo)志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發(fā)現(xiàn)有助于為發(fā)現(xiàn)海洛因成癮判定的潛在標(biāo)志物提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：海洛因； 代謝組學(xué)； 液相色譜聯(lián)合離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜

1引言

吸毒成癮的科學(xué)判定一直是困擾廣大緝毒及相關(guān)工作者的一大難題。近年來(lái)，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測(cè)靈敏度及借助多種先進(jìn)的分析手段來(lái)解決此難題，但均未取得突破性的進(jìn)展。代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的，是通過對(duì)分子量小于1000 Da的內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行定性與定量分析，揭示這些內(nèi)源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動(dòng)規(guī)律等的相互關(guān)系的一門新興科學(xué)[1～3]。代謝組學(xué)一經(jīng)提出，便受到廣泛關(guān)注，并已在很多領(lǐng)域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行代謝組學(xué)研究罕見報(bào)道。本研究將代謝組學(xué)的研究方法引入到毒品濫用領(lǐng)域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學(xué)研究有望將毒品鑒定的時(shí)限延長(zhǎng)，為停止吸毒一段時(shí)間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級(jí)，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實(shí)驗(yàn)室PURELAB UHQ超純水系統(tǒng)（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測(cè)試劑盒（MOR）購(gòu)自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來(lái)自16例海洛因?yàn)E用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結(jié)果與討論

3.1海洛因?yàn)E用成癮人員血清代謝組學(xué)研究多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

代謝組學(xué)研究中數(shù)據(jù)分析過程應(yīng)用的主要手段為模識(shí)別技術(shù)，包括非監(jiān)督方法和有監(jiān)督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監(jiān)督法，用于考察正常組和海洛因?yàn)E用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質(zhì)量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個(gè)參數(shù)評(píng)估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預(yù)測(cè)能力。用PCA法建模后，自動(dòng)篩選出具有代表性意義的兩個(gè)主成分，這兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數(shù)據(jù)，Q2（cum）為0.564即模型的預(yù)測(cè)能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時(shí)進(jìn)行了有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PLSDA 可以根據(jù)樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結(jié)果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因?yàn)E用成癮組內(nèi)源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預(yù)測(cè)能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數(shù)據(jù)整合起來(lái)進(jìn)行PCA建模，結(jié)果如圖5所示。模型參數(shù)R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數(shù)。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預(yù)測(cè)能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區(qū)分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結(jié)論

本研究考察了海洛因?yàn)E用成癮者血清中可能的潛在標(biāo)志物，并對(duì)尿液中的潛在標(biāo)志物也進(jìn)行了篩選。毒品尿液樣本的檢測(cè)時(shí)限一般為2～3 d，超過這個(gè)時(shí)限，現(xiàn)有檢測(cè)方法很難檢測(cè)出毒品及其中間代謝產(chǎn)物，本研究所選海洛因?yàn)E用成癮樣本均為海洛因檢測(cè)試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測(cè)的時(shí)限。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區(qū)分開，說明本方法可延長(zhǎng)毒品檢出的時(shí)限性。在發(fā)現(xiàn)海洛因?yàn)E用成癮可能的潛在標(biāo)志物方面，24種內(nèi)源性代謝物對(duì)成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了代謝組學(xué)在毒品濫用研究領(lǐng)域方面的可行性和潛在的價(jià)值，豐富了代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，為海洛因?yàn)E用成癮的科學(xué)判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112