方彩云　張曉勤　陸豪杰

摘要：棕櫚?；揎検堑鞍踪|(zhì)翻譯后脂質(zhì)修飾的重要形式之一，在細胞信號傳導、代謝、凋亡、疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中都起著重要的作用。因此，定性和定量分析蛋白質(zhì)棕櫚?；揎棇斫馄渖飳W功能具有重要意義。本文綜述了近年出現(xiàn)的蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椃治黾夹g(shù)和方法及其優(yōu)缺點，并對其未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

關(guān)鍵詞：棕櫚酰化修飾； 質(zhì)譜技術(shù)； 蛋白質(zhì)組學； 評述

1引言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)生使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復雜、功能更完善，在生物體內(nèi)起著極為重要的作用，脂類修飾便是其中一種非常重要的翻譯后修飾形式。棕櫚酸鹽是豐度最高的脂肪酸，可被共價修飾到蛋白質(zhì)上。根據(jù)連接方式不同，棕櫚?；揎椏煞譃镹型（通過酰胺鍵連接到Gly/Cys殘基上）和S型。蛋白質(zhì)的S型棕櫚?；揎棧≒almitoylation）是指飽和的16個碳的棕櫚酸鹽通過硫酯鍵共價修飾到蛋白質(zhì)Cys的巰基上[1]，如圖1所示），它是一種動態(tài)、可逆的翻譯后修飾形式，可在時間和空間上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。許多棕櫚?；揎椀目扇芑蛘夏さ鞍踪|(zhì)，如信號蛋白質(zhì)（包括在癌癥和突觸信號中斷關(guān)鍵因子）、細胞黏附分子和神經(jīng)遞質(zhì)受體等，可調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，蛋白蛋白相互作用，促進蛋白質(zhì)定位膜脂筏等，在細胞信號傳導、代謝、凋亡、疾病的發(fā)生和癌變中都起著重要的作用[1，2]。

深入研究和理解蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀臋C制，定性和定量分析含這種修飾的蛋白質(zhì)，以及對棕櫚?；腿プ貦磅；揎椣嚓P(guān)酶的理解、動態(tài)監(jiān)控棕櫚?；腿プ貦磅；闹芷?，對理解復雜信號通路的空間和時間調(diào)節(jié)等都具有重要意義。定點突變法是傳統(tǒng)的方法。一般是將候選的半胱氨酸Cys殘基突變?yōu)镾er或Ala，將突變體克隆和野生型分別轉(zhuǎn)染細胞，并比較兩者的功能差異。但這種方法不能直接檢測內(nèi)源蛋白質(zhì)，棕櫚酰化修飾位點的突變可能會導致附近的Cys殘基發(fā)生異常[3]。此外，許多蛋白質(zhì)棕櫚?；种苿┘叭プ貦磅；淖貦磅Ａ蛑敢脖粡V泛使用，例如，2溴軟脂酸乙烯（2Bromopalmitate， 2BP）[4]，淺藍菌素（Cerulenin）和衣霉素（Tunicamycin）等都具有較好的效果[5]。盡管這些方法的應用促進了人們對蛋白質(zhì)棕?；揎椀恼J識，但在沒有任何修飾位點信息提示的情況下，這樣的研究過程不但耗時費力，而且棕櫚酰化修飾位點的鑒定比較困難。這是因為：（1）雖然已知一些蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域中有保守的DHHC motif，且也已發(fā)現(xiàn)幾種去?；福鞍踪|(zhì)發(fā)生S棕櫚?；揎椇腿プ貦磅；揎椀拿笇W尚不清楚[6]；（2）還沒有明確的蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾的共識基序（Consensus motif）[7]；（3）棕櫚酰化修飾通常發(fā)生在跨膜蛋白或膜相關(guān)的蛋白質(zhì)[8]，而膜蛋白的溶解度和豐度低，長鏈脂肪酸的加入更進一步增加了其疏水性，增加了檢測難度；（4）不像磷酸化和糖基化修飾，它沒有親和基團如棕櫚?；揎椞禺惖目贵w等用于富集低豐度的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)。因此，人們對它的認識遠不及糖基化、磷酸化等其它翻譯后修飾。

目前，隨著質(zhì)譜和組學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)及其修飾位點得到了鑒定，極大地促進了人們對蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀睦斫狻榇?，本文就基于質(zhì)譜和組學手段的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)/肽段的分析方法及其進展進行了綜述。

2生物信息學預測方法

3質(zhì)譜法直接檢測蛋白質(zhì)的棕櫚?；揎椢稽c和脂質(zhì)基團

質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點，能準確分析連接到酰化修飾蛋白質(zhì)甚至是單一?；揎椢稽c上的脂肪酸種類。一般是通過層析或免疫沉淀等方法獲得目標蛋白質(zhì)，根據(jù)序列的特性選擇合適的酶進行蛋白質(zhì)酶解后，然后比較羥胺處理前后相應酶解肽段的質(zhì)量會發(fā)生變化，從而可通過質(zhì)譜方法鑒定該?；揎椈鶊F的分子特性[14]。Hemagglutinin（HA）是一個主要的包膜糖蛋白調(diào)節(jié)病毒和細胞膜融合，通過含有一個跨膜域和一個胞質(zhì)尾的輕HA2鏈錨定在病毒包膜上，C末端區(qū)域的3個Cys殘基（一個在跨膜域，兩個在胞質(zhì)尾）是高度保守，且在所有HA亞型中都可能棕櫚?；?。Kordyukova等[15]用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF MS）分析流感病毒蛋白HA上脂肪酸的類型時發(fā)現(xiàn)，具有兩個胞質(zhì)Cys的Influenza B virus HA含有棕櫚酰化修飾，具有一個跨膜Cys的Influenza C virus HA發(fā)生了硬脂酸?；揎?，而有一個跨膜和兩個胞質(zhì)Cys的Influenza A virus HA則同時包含棕櫚酸鹽和硬脂酸?；揎棥erebryakova等[16]用MALDITOF MS分析A/X31（H3 subtype），A/Puerto Rico/8/34 （H1 subtype）和A/FPV/Weybridge/34 （H7 subtype）病毒中C末端HA2肽段時，發(fā)現(xiàn)這些肽段不僅能被棕櫚酸鹽修飾，還能被硬脂酸修飾，且3株病毒中棕櫚酸/硬脂酸的比例不同，其中A/FPV/Weybridge/34病毒株優(yōu)先結(jié)合硬脂酸。Ozols等[17]用溴化氰裂解、Trysin和LysC酶解純化的含[3H]palmitate標記的αTubulin后進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，與C20， C213和C305相比，C376是主要的棕櫚酰化修飾位點。Bizzozero等[18]發(fā)現(xiàn)棕櫚酰化是天然髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP）的主要翻譯后修飾類型，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大多數(shù)的PLP和DM20是完全?；?。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）被廣泛用于復雜組分的分離與鑒定，其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，適于低分子化合物尤其是揮發(fā)性成分的分析。Sorek等用GCMS分析了蛋白質(zhì)AtROP6[19]和CBL1[20]上的脂質(zhì)基團；在氧化鉑（Ⅳ）存在下，通過氫化反應將S棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)的巰酯鍵打斷，釋放蛋白質(zhì)上的脂肪酸基團并用純甲酸和乙醇產(chǎn)生乙基酯化后，用GCMS分析了蛋白質(zhì)的S棕櫚酰化修飾，該法能分析低至1 μg的純化蛋白質(zhì)，并可實現(xiàn)S棕櫚?；降南鄬Χ縖21]，他們認為，通過氫化反應并結(jié)合乙基酯化可得到極性基團的脂肪酸，提高GC的分離和鑒定。體外轉(zhuǎn)移甲基和穩(wěn)定同位素標記法（iFAT）結(jié)合GCMS方法可定量比較不同細胞狀態(tài)下的酰基修飾[22]，iFAT法適于處理疏水性的膜蛋白質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫檢索和標準脂肪酸甲酯的色譜保留時間可實現(xiàn)?；蔫b定，穩(wěn)定同位素標記可用作內(nèi)標準確比較不同細胞狀態(tài)下?；揎?。

但許多棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)是膜蛋白，疏水性較強，不容易得到純化的蛋白質(zhì)樣品，這在一定程度上限制該方法的應用。

4以“棕櫚酸鹽為中心”的分析方法

4.1放射性棕櫚酸鹽代謝標記法

最經(jīng)典的方法是用放射性棕櫚酸鹽（例如，3Hpalmitate和125Ipalmitate）代謝標記培養(yǎng)細胞，通過放射自顯影檢測同位素標記的程度，檢測棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)，其中，3Hpalmitate是使用最廣泛的放射性標記棕櫚酸鹽[23]。但該法操作繁瑣、需很長的曝光時間；使用較高濃度的放射性同位素，有害且處理費用高；只能用于檢測活細胞中的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)；產(chǎn)生的信號弱，靈敏度不高，不能檢測豐度較低的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)；無法提供棕櫚酰化修飾的化學計量信息，且缺乏直接富集和鑒定放射性標記蛋白質(zhì)的方法。

4.2棕櫚酸脂類似物代謝標記法

疊氮或炔基脂肪酸探針非常靈敏，為快速檢測和富集細胞脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)提供了機會。由于含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物從結(jié)構(gòu)和功能上來說都與它們的天然產(chǎn)物相似，因此能通過代謝通路進入到細胞蛋白質(zhì)中。將含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物代謝進入細胞蛋白質(zhì)，然后通過化學選擇性鏈接如施陶丁格連接[24]或點擊化學[25]方法，選擇性地將帶疊氮或炔基基團的蛋白質(zhì)連接到生物素或熒光基團上，從而富集或檢測棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)。與放射性棕櫚酸鹽代謝標記方法相比，該法不使用放射性同位素，檢測時間較短，熒光基團的使用大大提高了方法的靈敏度，可通過親和純化富集或利用熒光探針觀察棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)。

4.2.2以炔基為化學報告基團的方法雖然疊氮基脂肪酸類似物在檢測蛋白質(zhì)脂肪酸?；揎椃矫嫒〉昧撕艽蟮倪M展，但添加一個疊氮基團到脂肪酸鏈上，可能會干擾脂肪酸的疏水性及其進入脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的機制。而炔基可保留脂肪酸碳鏈的疏水性，減少脂肪酸物理化學性質(zhì)的變化及其與脂質(zhì)間的相互作用，且具有代謝惰性（圖2）。另外，通過點擊化學捕獲比施陶丁格連接的效率要高，因此炔基探針通常要優(yōu)于疊氮修飾的探針，具有更高的靈敏度和檢測效率[30]。利用基團熒光檢測方法可提供研究動態(tài)復雜的生物過程的手段[31]，定量熒光顯微鏡方法能用來研究活細胞內(nèi)GFPtagged棕櫚酰化蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位和運輸[32，33]。因此，Hannoush等[34]將一系列不同碳鏈長度的ω炔基脂肪酸加到哺乳動物細胞系中，通過加成反應將目標蛋白質(zhì)連接到帶疊氮基團的生物素或熒光基團上，然后利用鏈霉親和素連接的辣根過氧化物酶進行免疫印跡分析，并通過高分辨的共聚焦顯微鏡分析了含ω炔基脂肪酸蛋白質(zhì)的亞細胞分布以及脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)在細胞分化不同階段的分布情況。Zhang等[35]利用串聯(lián)標記和檢測的方法同時監(jiān)控動態(tài)的S棕櫚?；揎椇偷鞍踪|(zhì)的更新，他們同時用兩種不同的化學報告基團進行代謝標記，一種用于檢測動態(tài)的S棕櫚?；揎棧硪粋€則用來監(jiān)控蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率，隨后用正交熒光標簽依次地進行點擊化學反應，從而有效地分析細胞中棕櫚酸鹽的循環(huán)周期。他們也發(fā)現(xiàn)，較短的脂肪酸類似物（az12和alk12）優(yōu)先標記Nmyristoylated蛋白質(zhì)， 而較長的脂肪酸衍生物（az15和alk16））則會進入S棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)中[36]。Yount等[37]用alk16[38]為化學報告基團，分析了鼠樹突狀細胞系中棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組，共鑒定到157個具有不同細胞功能的脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)（其中60個和97個被分別為高可信度和中可信度），他們的研究發(fā)現(xiàn)，IFITM3的抗病毒活性受到S棕櫚酰化修飾的調(diào)控。Yap等[39]將ω炔基棕櫚酸鹽類似物代謝進入GAPDH或線粒體3羥基3甲基戊二?；鵆oA合成酶，通過點擊化學與疊氮的生物素探針或熒光探針3azido7hydroxycoumarin反應快速檢測棕櫚酰化修飾。Martin等[40]用商品化的17Octadecynoic acid （17ODYA）作為生物正交、點擊化學探針進行原位標記，從永生的Jurkat T細胞中共鑒定了125個高可信度和大約200個中間可信度的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)，包括G蛋白、受體和一些質(zhì)膜定位依賴于棕櫚?；揎椀乃饷傅?。這是首個哺乳動物細胞棕櫚酰化蛋白質(zhì)組的分析。隨后，又將17ODYA代謝標記和SILAC（Stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）法相結(jié)合，在小鼠T細胞雜交瘤細胞中定性和定量了400多個棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)，并用17ODYA代謝脈沖追蹤標記方法分辨穩(wěn)定的和更新較快的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)[41]。

綜上，雖然“以棕櫚酸鹽為中心”方法有其優(yōu)點，但也存在不足之處：需將放射性或化學修飾的棕櫚酸脂類似物代謝標記到細胞內(nèi)，故不能分析組織樣品和體液，且較難用于癌細胞，因為癌細胞中脂肪酸合成酶的過度表達和過度活躍會極大地降低外源性長鏈脂肪酸的攝入[42]；與相對穩(wěn)定的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)相比，該法可能會更加偏向棕櫚酸鹽更新較快的蛋白質(zhì)；只能分析特定的S酰化修飾，若引入棕櫚酸脂類似物，則只能分析棕櫚?；揎棧荒芊治銎渌?、更長或不飽和脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)；來自于天然脂肪酸和放射性標記的脂肪酸類似物之間的結(jié)構(gòu)差異帶來的生理影響還不清楚，真核細胞中代謝途徑非常復雜，棕櫚酸脂類似物可能會以不同的代謝途徑進入，導致無法預測的生物學效應。

ABE法的優(yōu)點是不需代謝標記，可分析細胞（包括癌細胞）、組織和體液樣品，盡管在檢測棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)方面有了很大的進展，但也有如下的局限性：（1）假陽性率相對較高：該法是巰酯鍵特異的方法而不是S棕櫚?；揎椞禺惖姆椒ǎ庠葱缘牧u胺水解敏感的巰酯鍵蛋白質(zhì)都可能被同時富集而造成假陽性。實際操作時，首先要確保蛋白質(zhì)中原先存在的自由巰基完全封閉，需嚴格控制自由巰基封閉試劑的種類、用量和孵育時間等；需控制反應時間、羥胺的濃度和溶液的pH值，保證羥胺完全切除棕櫚?；揎椈鶊F；去除棕櫚?；揎椈鶊F后，應完全標記新產(chǎn)生的自由巰基；用鏈霉親和素磁珠富集時，也可能會將體內(nèi)生物素化修飾蛋白質(zhì)富集而造成固有背景，以上這些因素會導致近三分之一的鑒定蛋白質(zhì)為假陽性結(jié)果[8， 54]。與ABE方法相比，點擊化學具有明顯較低的假陽性率[55]。因此，為減少假陽性結(jié)果，一般需進行對照實驗。（2）該法為間接檢測和純化方法，用該法得到的蛋白質(zhì)可能是棕櫚酸修飾的蛋白質(zhì)，也可能是對羥胺水解敏感的其它脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)，若需準確鑒定連接到蛋白質(zhì)上的脂質(zhì)類型，則需采用GCMS進一步分析。

6展望

由于缺乏明確的蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椢稽c，極大地阻礙了棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)功能的研究。盡管近年來已受到越來越多的重視，并取得了較大的進展，尤其是ABE法和棕櫚酸鹽類似物代謝標記方法的發(fā)展，使越來越多的棕櫚?；揎椢稽c得到了鑒定，但目前關(guān)于棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)組研究的報道主要集中于位點的鑒定，即定性研究，且現(xiàn)有方法也都各有其不足之處，因此，仍需致力于棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)定性與定量分析，發(fā)展更有效及準確特異的研究方法，比如，由于棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)為細胞膜蛋白或者是與膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，疏水性強，因此可結(jié)合細胞膜蛋白質(zhì)組學方法，增加膜蛋白的溶解性；現(xiàn)有分析方法操作步驟多，易造成樣品損失尤其是低豐度蛋白質(zhì)的損失，且鑒定結(jié)果的假陽性率高，因此可適當簡化操作流程，選用合適的去垢劑，采用選擇性好、富集效率高的新型富集載體，甚至是選用能同時滿足富集和定量分析要求的富集材料，并建立相應的分析方法；發(fā)展靈敏度高、選擇性好的熒光檢測試劑；發(fā)展一些代謝效率更高的脂肪酸類似物等，從而提高樣品分析的重復性、靈敏度和定量的準確性，以獲得更多可靠的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)及其位點的信息，甚至與活細胞成像等方法相結(jié)合，從而有助于進一步揭示動態(tài)S棕櫚酰化修飾的生物重要性和功能。

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