吳衛(wèi)星+申亮+張秀文+齊遵利

摘要：將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定的比例制成復(fù)方添加劑。將其以0（對照組）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基礎(chǔ)飼料中制成顆粒膨化飼料投喂鯉魚，研究復(fù)方中草藥提取物對鯉魚非特異性免疫及生長性能的影響。結(jié)果表明，鯉魚血清中的過氧化氫酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性均強(qiáng)于對照組，但是B2組的鯉魚又顯著強(qiáng)于其他3組；飼養(yǎng)后42 d，B1組和B2組鯉魚體質(zhì)量均高于對照組。

關(guān)鍵詞：復(fù)方中草藥；鯉魚；非特異性免疫；生長性能

中圖分類號：S942.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0236-03

近20年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)抗生素和激素這些添加劑的應(yīng)用對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展起一定的促進(jìn)作用，但同時也帶來了不可避免的負(fù)面效應(yīng)?？股氐拇罅渴褂煤蜑E用破壞了動物體內(nèi)微生態(tài)的平衡，導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，使動物免疫力下降^[1]。因此，世界上許多國家先后作出限用或禁用抗生素作飼料添加劑的決定，特別是歐盟已法定從 2000 年開始所有成員國全面禁止使用抗生素作飼料添加劑。2006 年，因?yàn)E用抗生素引起的“多寶魚事件”給我國大菱鲆主要養(yǎng)殖區(qū)（山東、河北）造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展。激素類的大量使用使動物體內(nèi)的非特異性免疫能力下降^[2]，所以天然的中草藥添加劑引起了國內(nèi)外的重視。

中草藥飼料添加劑是以自然界中動物、植物等為原料加工而成的飼料添加劑，具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)^[3]。但是，傳統(tǒng)的中草藥添加劑往往是將中草藥粉碎后直接添加到飼料中進(jìn)行投喂的，存在藥效慢、添加量大、適口性差、成本高等缺點(diǎn)。為了保證中草藥添加劑的效果，本試驗(yàn)采用高濃度中草藥和純中草藥提取物進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)魚為天津市換新水產(chǎn)良種場培育的健康鯉魚，規(guī)格約150 g/尾。鯉魚采購后，先用5%食鹽水浸泡20 min消毒，然后放入暫養(yǎng)池內(nèi)馴化2周。暫養(yǎng)期間，投喂飼料為基礎(chǔ)飼料，以鯉魚出現(xiàn)有規(guī)律攝食為馴化指標(biāo)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品

試驗(yàn)藥品成分為黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮，均購自河北征宇制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計與管理

將各試驗(yàn)藥品根據(jù)中草藥藥理及相互配伍原則配制，分別以0（對照）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基礎(chǔ)飼料中，每組3個平行，每個平行放置25尾試驗(yàn)魚，分別隨機(jī)放入12個網(wǎng)箱內(nèi)。每天08：00、12：00和16：00定時投喂，每天的投喂量約為體質(zhì)量的3%，隔天09：00清池?fù)Q水1/4，全天充氧，水溫控制在 25 ℃ 左右。

1.2.2 生長指標(biāo)的測定

喂養(yǎng)42 d后，每組撈取25尾魚稱重，計算各組魚的相對增重率和成活率。每天檢查草魚的發(fā)病或死亡情況，做好記錄，最后統(tǒng)計各組的成活率。飼料系數(shù)（CF）=飼料消耗量/增加的質(zhì)量；相對增重率=（末尾平均體質(zhì)量-初尾平均體質(zhì)量）/初尾平均體質(zhì)量×100%；成活率=試驗(yàn)?zāi)~總數(shù)/試驗(yàn)初魚總數(shù)×100%。

1.2.3 生化指標(biāo)的測定

1.2.3.1 血清的采集及制備

分別在試驗(yàn)后14、28、42 d 時，從每個試驗(yàn)處理組隨機(jī)取2尾魚，用盛有肝素鈉的一次性注射器采血2 mL，立即輕輕搖勻，使血液抗凝，置于 4 ℃ 冰箱內(nèi)保存。

1.2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的SOD試劑盒測定。原理：SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及其氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見光分光光度計測定其吸光度；當(dāng)樣品中含有SOD時，則因?qū)Τ蹶庪x子自由基專一性的抑制作用使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度低于對照管。定義：1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為1個活性單位（U）。

1.2.3.3 溶菌酶（LSZ）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的溶菌酶試劑盒測定。原理：在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖而使細(xì)菌裂解濃度降低，透光度增強(qiáng)，因此根據(jù)透光度變化來推測溶菌酶的活性。定義：在溫度為37 ℃、波長為530 nm下，1 min內(nèi)引起吸光度下降0.001為1個活性單位。

1.2.3.4 過氧化氫酶（CAT）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的過氧化氫酶試劑盒測定。原理：CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，通過測定其生成量可計算出CAT的活性。定義：1 mL血清或血漿1 s分解1 μmol的H2O2的量為1個活力單位（U）。

1.2.3.5 酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶試劑盒測定。原理：酸性磷酸酶或者堿性磷酸酶在分解產(chǎn)生磷酸苯二鈉的同時產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定ACP、AKP的活性。ACP活性單位的定義：100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金式單位。AKP活性單位的定義：100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.2.3.6 谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性的測定endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應(yīng)液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進(jìn)行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復(fù)方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強(qiáng)。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

3.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗(yàn)是按照醫(yī)學(xué)配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥添加劑能夠提高試驗(yàn)組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結(jié)果和許多學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進(jìn)草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進(jìn)作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機(jī)酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的復(fù)方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標(biāo)ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗(yàn)采樣的動物基本生理指標(biāo)差異不大，沒有在得病時被隨機(jī)取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強(qiáng)，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細(xì)胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學(xué)指標(biāo)后證實(shí)，該添加劑可顯著提高河蟹機(jī)體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進(jìn)仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認(rèn)了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細(xì)胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍(lán)根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中飼喂草魚，結(jié)果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強(qiáng)了^[12]。

綜合復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標(biāo)的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強(qiáng)于其他3組。因此，在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%復(fù)方中草藥添加劑效果最佳。

參考文獻(xiàn)：

[1]邱楚武. 抗菌素的合理選用[J]. 中國飼料，1998（4）：42-44.

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[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，張其中，楊瑩瑩，等. 不同劑量復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑對草魚生長性能和免疫功能的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應(yīng)液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進(jìn)行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復(fù)方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強(qiáng)。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

3.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗(yàn)是按照醫(yī)學(xué)配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥添加劑能夠提高試驗(yàn)組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結(jié)果和許多學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進(jìn)草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進(jìn)作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機(jī)酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的復(fù)方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標(biāo)ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗(yàn)采樣的動物基本生理指標(biāo)差異不大，沒有在得病時被隨機(jī)取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強(qiáng)，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細(xì)胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學(xué)指標(biāo)后證實(shí)，該添加劑可顯著提高河蟹機(jī)體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進(jìn)仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認(rèn)了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細(xì)胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍(lán)根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中飼喂草魚，結(jié)果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強(qiáng)了^[12]。

綜合復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標(biāo)的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強(qiáng)于其他3組。因此，在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%復(fù)方中草藥添加劑效果最佳。

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[8]蔡中華，陳成勛，邢克智，等. 四種中藥對鯉魚非特異性免疫功能的影響[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1998，5（2）：31-34.

[9]崔青曼，張耀紅，袁春營.中草藥、多糖復(fù)方添加劑提高河蟹機(jī)體免疫力的研究[J]. 水利漁業(yè)，2001，21（4）：40-41.

[10]Sun Y X，Jin L J，Wang T T，et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2） production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology，2008，147（3）：293-298.

[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，張其中，楊瑩瑩，等. 不同劑量復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑對草魚生長性能和免疫功能的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應(yīng)液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進(jìn)行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復(fù)方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強(qiáng)。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

3.1 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗(yàn)是按照醫(yī)學(xué)配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結(jié)果表明，復(fù)方中草藥添加劑能夠提高試驗(yàn)組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結(jié)果和許多學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進(jìn)草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進(jìn)作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機(jī)酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的復(fù)方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標(biāo)ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗(yàn)采樣的動物基本生理指標(biāo)差異不大，沒有在得病時被隨機(jī)取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強(qiáng)，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細(xì)胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學(xué)指標(biāo)后證實(shí)，該添加劑可顯著提高河蟹機(jī)體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進(jìn)仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認(rèn)了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細(xì)胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍(lán)根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中飼喂草魚，結(jié)果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強(qiáng)了^[12]。

綜合復(fù)方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標(biāo)的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強(qiáng)于其他3組。因此，在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%復(fù)方中草藥添加劑效果最佳。

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