劉文斌，李 睿，曾 馳，丁洪波

(1.武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

NOTCH1信號通路是少數(shù)幾個(gè)高度保守的發(fā)育相關(guān)的信號通路之一，它使得細(xì)胞間實(shí)現(xiàn)短程通訊。NOTCH1信號可以促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、特定細(xì)胞歸宿或者細(xì)胞分化的激活。這個(gè)信號通路中成員的不正常表達(dá)或功能異常會(huì)導(dǎo)致一系列發(fā)育紊亂甚至癌癥，例如Alagille綜合癥。某些重要的胚胎或干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作也離不開使用NOTCH1信號通路的拮抗劑［1］。NOTCH1信號通路的激活需要配體的結(jié)合及蛋白酶(如ADAM和γ-secretase)的切割，并離不開靶基因的功能發(fā)揮。NOTCH1主要的配體有 JAG1，JAG2，DLL1，DLL3 和 DLL4。NOTCH1的入核部分 ICN1與 CSL(CBF1，Su(H)，Lag-1)和MAML1(Mastermind-like 1)結(jié)合后才能啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。NOTCH1靶基因的激活轉(zhuǎn)錄根據(jù)CSL的有無，可分為CSL依賴性的和非CSL依賴性的。CSL通過幾個(gè)轉(zhuǎn)錄共抑制因子，如 SMRT、NcoR、CIR、SHARP、KyoT2 和 Skip［2-6］，來招募組蛋白去乙?；讣捌渌旧|(zhì)修飾酶，抑制NOTCH1靶基因的表達(dá)。當(dāng)激活的ICN1進(jìn)入細(xì)胞核后，它取代了這些抑制因子及其它染色質(zhì)修飾蛋白，而與CSL形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，從而招募其它蛋白進(jìn)一步形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，如MAML1，這樣NOTCH1靶基因才得以表達(dá)。

目前已知的NOCTH1靶基因有HES1，HERP1，Cyclin D1，NF-κB 等，但是找到更多的 NOTCH1靶基因，對于深刻、全面理解NOTCH1的功能是非常重要和有意義的。

筆者通過分析CSL所結(jié)合的NOTCH1靶基因啟動(dòng)子的特點(diǎn)，找到一些預(yù)選基因，通過RT-PCR及蛋白表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)SEPT4是NOTCH1的靶基因。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)，抗體及其它試劑

DMEM液體培養(yǎng)基購自Cellgro公司。胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自HyClone公司。Trizol購自Invitrogen公司。

抗NOTCH1抗體和抗SEPT4抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司?？辜?dòng)蛋白(β-actin)抗體購自Sigma公司?？俁NA純化系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增試劑盒購自Promega公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Applied Biosystems。

1.2 ICN1，CSL，MAML1 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 U2OS 的構(gòu)建

U2OS細(xì)胞系是一種人類骨肉瘤細(xì)胞系，它不表達(dá)可以檢測到的內(nèi)源性NOTCH1蛋白，因此，我們使用pFLAG-CMV-2、pcDNA3和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GFP將 MAML1、CSL、ICN1和 GFP導(dǎo)入U(xiǎn)2OS細(xì)胞系，從而建立一株 CSL-MAML1-GFPU2OS細(xì)胞系 (命名為 GFP)和一株 CSL-MAML1-ICN1-GFP-U2OS細(xì)胞系(命名為ICN1)。

1.3 半定量和定量PCR

使用Trizol法從CSL-MAML1-GFP-U2OS細(xì)胞系和CSL-MAML1-ICN1-GFP-U2OS細(xì)胞系抽提總RNA，并用SV Total RNA Isolation System進(jìn)行純化，然后進(jìn)行使用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。半定量PCR:根據(jù)cDNA的質(zhì)量及靶基因的豐度將cDNA進(jìn)行稀釋。PCR循環(huán)步驟如下:96℃2 min，94 ℃1 min，56 ℃45 s，72 ℃30 s，重復(fù) 24 個(gè)循環(huán)。55 ℃2 min，94 ℃1 min，56 ℃45 s，72 ℃30 s，重復(fù)4個(gè)循環(huán)。55℃2 min，94℃1 min，56℃45 s，72℃30 s，重復(fù)4個(gè)循環(huán)。55℃2 min，94℃1 min，56℃45 s，72℃30 s，重復(fù)4個(gè)循環(huán)。72℃5 min。以GAPDH作為內(nèi)參。定量PCR:將cDNA進(jìn)行稀釋，然后使用Applied Biosystems公司的7500 Fast Machine進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)如下:95℃，10 min，94 ℃，45 s，56 ℃，45 s，72 ℃，45 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列見表1。

表1 NOTCH1潛在靶基因PCR引物DNA序列

續(xù)表

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

將U2OS細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，到達(dá)一定豐度后收集細(xì)胞，并用裂解緩沖液(20 mM Tris-Cl，150 mM NaCl，10% 甘油，1%NP-40，0.4% 氟化鈉，100 mM 釩酸鈉，10 μg/mL pepstatin，10 μg/mL leupeptin，10 μg/mL aprotinin，pH 7.4)來裂解細(xì)胞，在冰上放置 30 min，10 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，去沉淀，上清即總蛋白，測定蛋白濃度。將50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上，使用5%的脫脂牛奶4℃封閉過夜，或室溫2 h，然后使用加Tween-20的緩沖液TBST沖洗5遍。在膜上加針對SEPT4的一抗，4℃反應(yīng)過夜，或室溫2 h，再使用TBST沖洗5遍后加入酶標(biāo)記的二抗，室溫1 h，使用TBST沖洗，然后使用Pierce ECL底物進(jìn)行反應(yīng)，顯色發(fā)光，沖洗X光片。

2 結(jié)果與分析

2.1 NOTCH1靶基因的生物信息學(xué)分析

當(dāng)NOTCH1激活它的靶基因時(shí)，位于細(xì)胞膜上的兩個(gè)酶Disintegrin and metalloproteinase domaincontaining protein 10和 γ-secretase切割 NOTCH1，使其產(chǎn)生一個(gè)入核片段ICN1。ICN1進(jìn)入細(xì)胞核之后與共激活因子CSL和MAML1結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，并且CSL結(jié)合在DNA的核心區(qū)，TGGGAA，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。我們把已知的NOTCH1靶基因的CSL結(jié)合區(qū)序列作為一個(gè)“位置權(quán)重模塊(position weight matrix，PWM)”，再使用該模塊在全基因組范圍內(nèi)搜尋潛在的結(jié)合區(qū)，全基因組涵蓋了非冗余的人類、小鼠和大鼠的啟動(dòng)子序列。我們通過比較由Eukaryotic Promoter Database［7］提供的這三個(gè)物種的啟動(dòng)子同源區(qū)來評估該潛在結(jié)合區(qū)的保守區(qū)。通過PromoSer 3.0軟件，我們鑒定了21個(gè)以前從未研究過的NOTCH1可能的靶基因。

2.2 SEPT4和 FRMD4A在轉(zhuǎn)染 ICN1的 U2OS細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄增加

半定量PCR的結(jié)果顯示，在21個(gè)NOTCH1潛在靶基因中，有15個(gè)基因的基因轉(zhuǎn)錄在U2OS細(xì)胞中被NOTCH1(ICN1是其活化的入核片段)上調(diào)(圖1)，其中，SEPT4，CDC25A，F(xiàn)RMD4A 和 NUDCD1 基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)較為明顯。6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄被下調(diào)(圖2)，其中，F(xiàn)UT9基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)明顯。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，在15個(gè)上調(diào)基因中，SEPT4基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)最為明顯，轉(zhuǎn)錄量是對照細(xì)胞SEPT4的10.48倍(圖3)，而FRMD4A和CD44基因的轉(zhuǎn)錄量約為對照細(xì)胞的1.5倍以上(圖4)。在6個(gè)下調(diào)基因中，GRHL1基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)較為明顯，轉(zhuǎn)錄量只有對照細(xì)胞的0.7倍左右(圖5)。

圖1 受NOTCH1影響表達(dá)上調(diào)基因的半定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

圖2 受NOTCH1影響表達(dá)下調(diào)基因的半定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

圖3 受NOTCH1影響，SEPT4基因表達(dá)明顯上調(diào)

圖4 受NOTCH1影響表達(dá)上調(diào)靶基因的定量PCR結(jié)果

圖5 受NOTCH1影響表達(dá)下調(diào)靶基因的定量PCR結(jié)果

2.3 SEPT4蛋白在轉(zhuǎn)染ICN1的U2OS細(xì)胞中表達(dá)增加

在半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR中，結(jié)果非常一致的有表達(dá)上調(diào)的SEPT4和FRMD4A基因。由于FRMD4A研究較少，沒有合適的商業(yè)化抗體，筆者挑選SEPT4基因作為進(jìn)一步蛋白表達(dá)的鑒定對象。筆者使用pFLAG-CMV-2、pcDNA3和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMSCV-GFP將 GFP、ICN1、CSL和 MAML1基因轉(zhuǎn)入U(xiǎn)2OS細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白的過表達(dá)。如圖6所示，與對照細(xì)胞(GFP)相比，在表達(dá)ICN1的細(xì)胞中，SEPT4的蛋白表達(dá)被明顯上調(diào)了。因此，SEPT4是NOTCH1的一個(gè)靶基因。

圖6 NOTCH1靶基因SEPT4蛋白表達(dá)的Western blot分析

3 結(jié)論

筆者的生物信息學(xué)分析、半定量PCR分析和定量PCR分析均表明在轉(zhuǎn)染了ICN1、CSL和MAML1基因的細(xì)胞中，SEPT4和FRMD4A基因的轉(zhuǎn)錄被ICN1明顯上調(diào)了，而ICN1是NOTCH1被激活的入核片段。蛋白表達(dá)分析還表明SEPT4的表達(dá)被ICN1上調(diào)了，因此，SEPT4是NOTCH1的靶基因。

［1］Kopan R，Ilagan M X G.The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism ［J］.Cell，2009，137(2):216-233.

［2］Kao H Y，Ordentlich P，Koyano-Nakagawa N，et al.A histone deacetylase corepressor complex regulates the Notch signal transduction pathway［J］.Genes Dev，1998，12:2269-2277.

［3］Hsieh J J，Zhou S，Chen L，et al.CIR，a corepressor linking the DNA binding factor CBF1 to the histone deacetylase complex［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:23-28.

［4］Oswald F，Kostezka U，Astrahantseff K，et al.SHARP is a novel component of the Notch/RBP-Jκ signaling pathway［J］.EMBO J，2002，21:5417-5426.

［5］Taniguchi Y，F(xiàn)urukawa T，Tun T，et al.LIM protein KyoT2 negatively regulates transcription by association with the RBP-J DNA binding protein ［J］.Mol Cell Biol，1998，18:644-654.

［6］Zhou S，F(xiàn)ujimuro M，Hsieh J J，et al.Skip，a CBF1-associated protein，interacts with the ankyrin repeat domain of NotchIC to facilitate NotchIC function ［J］.Mol Cell Biol，2000，20:2400-2410.

［7］Eukaryotic Promoter Database［DB］.http//www.epd.isb － sib.ch/.