石亮亮 劉明東 朱 浩 陳 敏 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種臨床常見的急腹癥，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)可導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)，是造成SAP高死亡率的重要原因［1-2］。SAP相關(guān)肺損傷的發(fā)生率約為15% ～55%［3］，急性肺損傷是SAP早期最主要的死亡原因，然而其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是AP發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵介質(zhì)之一，炎癥因子可激活JNK信號(hào)通路，而該通路激活又可進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［4］。丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS)是中藥丹參提取物丹參酮ⅡA的水溶性衍生物，既往研究發(fā)現(xiàn)該制劑能阻斷JNK信號(hào)通路激活［5］，并對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用［6］。本研究建立急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠模型并予STS預(yù)處理，通過觀察ANP大鼠的肺組織損傷程度、炎癥因子表達(dá)和JNK信號(hào)通路的活化情況，探討STS對(duì)SAP相關(guān)肺損傷的抗炎作用及其可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g，由南京鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STS注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H31022558)，大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(Bender MedSystems，eBioscience Inc.)，兔抗大鼠 SAPK/JNK、Phospho-SAPK/JNK單克隆抗體(Cell Signaling Technology，Inc.)，抗 GAPDH 兔多克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，山羊抗兔 IgG(Molecular Probes?，Thermo Fisher Scientific Inc.)。

二、方法

1.動(dòng)物分組和ANP模型制備:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、ANP組和STS組，每組12只。ANP組和STS組予新鮮配制的5%牛磺膽酸鈉(1.0 mL/kg)從十二指腸乳頭處逆行穿刺注入主胰管建立ANP模型，假手術(shù)組開腹后僅翻動(dòng)十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次后關(guān)腹。STS組于造模前30 min予腹腔注射 STS 1.0 mg/kg預(yù)處理［6］。造模后 12 h 和 24 h分批處死動(dòng)物，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.常規(guī)病理學(xué)檢查:取大鼠胰腺組織和部分右肺組織，4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.肺損傷評(píng)分［7］:根據(jù)肺組織水腫、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和小氣道損傷四項(xiàng)病理變化進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)變化按程度分為5級(jí)。0級(jí):無(wú)該項(xiàng)病理變化;1級(jí):病理變化輕且很局限;2級(jí):病理變化中等且局限;3級(jí):病理變化中等但廣泛或局部很顯著;4級(jí):非常顯著的廣泛性病理變化。

4.肺組織促炎細(xì)胞因子含量測(cè)定:取部分右肺組織制成5%勻漿，－20℃保存待測(cè)。采用ELISA方法，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定肺組織TNF-α、IL-1β 含量。

5.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織JNK、p-JNK蛋白表達(dá):制備肺組織勻漿，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白，按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗(1∶1000)4℃過夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入 ECL發(fā)光液，顯影，定影，掃描膠片，Quantity One軟件分析各條帶光密度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。每一樣本至少重復(fù)檢測(cè)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胰腺和肺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠胰腺和肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。ANP 12 h組胰腺腺泡間隙明顯擴(kuò)大，小葉結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，邊界不清，胰腺內(nèi)出現(xiàn)片狀壞死、出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);24 h組胰腺壞死區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減輕。STS組胰腺組織損傷較ANP組減輕，壞死面積減小，可見點(diǎn)狀出血。ANP 12 h組肺組織肺泡壁增厚，間隔增寬，間質(zhì)毛細(xì)血管充血、淤血，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);24 h組肺組織實(shí)變更為明顯。STS組肺組織損傷較ANP組減輕，實(shí)變面積減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕(見圖1)。

圖1 ANP組和STS組造模后24 h肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×200)

二、肺損傷評(píng)分

ANP 12 h組和24 h組肺組織水腫、出血、白細(xì)胞浸潤(rùn)和小氣道損傷的病理學(xué)評(píng)分均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P＜0.05);STS組與同時(shí)間點(diǎn)ANP組相比，各項(xiàng)病理學(xué)評(píng)分均顯著降低(P＜0.05)(見表1)。

三、肺組織 TNF-α、IL-1β 表達(dá)

ELISA法檢測(cè)顯示，ANP 12 h組和24 h組肺組織TNF-α、IL-1β含量均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P＜0.05);STS組與同時(shí)間點(diǎn)ANP組相比，TNF-α、IL-1β 含量均顯著降低(P ＜0.05)(見表1)。

四、肺組織JNK、p-JNK蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，ANP 12 h組和24 h組肺組織JNK及其活化形式p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P＜0.05);STS組與同時(shí)間點(diǎn)ANP組相比，JNK表達(dá)無(wú)明顯變化，p-JNK表達(dá)顯著降低(P ＜0.05)(見圖2、表1)。

討 論

除胰腺和胰周壞死外，SAP患者還伴有持續(xù)且不能自行恢復(fù)的呼吸、心血管或腎臟功能衰竭，可累及一個(gè)或多個(gè)臟器［8］，病死率高達(dá)36% ～50%。急性肺損傷及其引起的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是SAP最常見的胰外表現(xiàn)，使SAP早期死亡率明顯增高［3］。SAP相關(guān)肺損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，有多種黏附分子、炎癥介質(zhì)參與其間，但確切機(jī)制迄今仍未闡明，因此尚無(wú)針對(duì)病因的有效治療措施，減輕肺損傷可能降低SAP的死亡率。

圖2 三組各時(shí)間點(diǎn)肺組織JNK、p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖

MAPKs廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、死亡以及細(xì)胞間功能的同步等一系列生命活動(dòng)。JNK是MAPKs家族的重要成員之一，可被應(yīng)激刺激、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等激活。研究發(fā)現(xiàn)在多種因素誘導(dǎo)的肺損傷動(dòng)物模型中，炎癥因子如TNF-α、IL-1等引起的 JNK信號(hào)通路激活可通過上調(diào)激活蛋白-1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控一系列炎癥相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)肺損傷發(fā)生［9-14］。因此，JNK信號(hào)通路是肺損傷炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，炎癥因子激活JNK信號(hào)通路，該通路激活又使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步放大。本課題組前期研究［15］證實(shí)JNK信號(hào)通路在SAP相關(guān)肺損傷中起關(guān)鍵作用，由此推測(cè)JNK特異性抑制劑可能有助于減輕SAP相關(guān)肺損傷。

表1 三組各時(shí)間點(diǎn)肺損傷評(píng)分、肺組織促炎細(xì)胞因子和JNK、p-JNK蛋白表達(dá)比較(n=6，)

表1 三組各時(shí)間點(diǎn)肺損傷評(píng)分、肺組織促炎細(xì)胞因子和JNK、p-JNK蛋白表達(dá)比較(n=6，)

a與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，P＜0.05;b與同時(shí)間點(diǎn)ANP組比較，P＜0.05

本實(shí)驗(yàn)對(duì)ANP小鼠肺組織的組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，毛細(xì)血管通透性增加，肺損傷評(píng)分明顯增高。中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺組織并被激活產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子在肺損傷中起關(guān)鍵作用，其中IL-1是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中最早釋放的炎癥介質(zhì)之一，而TNF-α可誘導(dǎo)單核因子如IL-1β、IL-6合成，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)其破壞性［16］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ANP小鼠肺組織的檢測(cè)顯示，造模后12 h和24 h，肺組織TNF-α、IL-1β 含量均明顯增高，同時(shí)JNK、p-JNK表達(dá)上調(diào)，提示炎癥因子激活JNK信號(hào)通路。進(jìn)一步觀察經(jīng)STS預(yù)處理的ANP小鼠，發(fā)現(xiàn)該組小鼠肺組織JNK表達(dá)無(wú)明顯變化，但p-JNK表達(dá)明顯下調(diào)，提示JNK信號(hào)通路活化受抑，同時(shí)肺組織TNF-α、IL-1β含量和肺損傷評(píng)分均明顯降低，提示STS可能通過抑制JNK信號(hào)通路激活而在SAP相關(guān)肺損傷中發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，SAP相關(guān)肺損傷有JNK信號(hào)通路參與其中，STS干預(yù)能下調(diào)ANP大鼠的肺組織炎癥因子表達(dá)，降低肺損傷程度，其機(jī)制可能與抑制JNK信號(hào)通路激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的缺陷之處在于未能對(duì)STS的適宜劑量進(jìn)行探討，有待后續(xù)研究加以完善。

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