趙會(huì)君 孔 炫 房靜遠(yuǎn)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中居第四位［1］。動(dòng)物脂肪攝入量增加是促進(jìn)結(jié)直腸癌形成的重要因素［2］。動(dòng)物脂肪攝入量增加可促進(jìn)膽汁酸分泌，導(dǎo)致體內(nèi)次級(jí)膽汁酸含量增加。脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)是參與腸肝循環(huán)的一種次級(jí)膽汁酸，研究［3］顯示結(jié)直腸癌患者糞便中的DCA含量明顯高于健康人，且DCA含量升高的結(jié)直腸癌患者腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。Yui等［4］的研究顯示，DCA可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞DNA損傷、線粒體破壞，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，并可引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性，導(dǎo)致基因突變增加，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生。Da Silva等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，DCA在體外可通過激活蛋白激酶B和p38，促進(jìn)ERK1/2磷酸化，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。DCA是生理狀態(tài)下體內(nèi)長期存在的代謝分子，然而目前研究多為以高濃度DCA短時(shí)間刺激細(xì)胞，采用長時(shí)間慢性刺激的研究甚少。本研究以DCA長時(shí)間刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，探討DCA在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用及其機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的防治提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自American Type Culture Collection(ATCC)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中(37℃，5%CO2)。DCA、DMSO購自Sigma公司，CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司，Transwell小室購自Millipore公司，Bradford蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)抗體、鼠抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)抗體、兔抗人維生素D受體(VDR)抗體購自Abcam公司，GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗購自上?？党缮锕こ逃邢薰?，ECL試劑盒購自Pierce公司。

二、方法

1.細(xì)胞增殖率檢測:取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，更換為無血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，分別以含DCA 12.5、50、200 μmol/L 和 DMSO 的培養(yǎng)基處理細(xì)胞0、12、24、36 h，吸除培養(yǎng)基，加入 100 μL 無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(陰性對照孔A值-空白孔A值)×100%，根據(jù)細(xì)胞增殖率繪制生長曲線。

2.細(xì)胞遷移能力檢測:取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，以含 DCA 12.5 μmol/L的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，以含DMSO的培養(yǎng)基作為陰性對照組。培養(yǎng)3 d后消化細(xì)胞，接種于6孔板培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到100%，以無菌黃色Tip頭于6孔板內(nèi)劃痕，PBS沖洗，加入含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，顯微鏡下多位點(diǎn)拍照，4 d后再次拍照觀察劃痕愈合情況。

3.細(xì)胞侵襲能力檢測:細(xì)胞培養(yǎng)同遷移能力檢測。培養(yǎng)5 d后消化細(xì)胞，以含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1.0×106/mL。以經(jīng)無血清培養(yǎng)基稀釋的 Matrigel基質(zhì)膠(1∶3)包被Transwell小室底部膜的上室面，待基質(zhì)膠稀釋液聚合成凝膠，取細(xì)胞懸液200 μL加入小室，下室加入含30%胎牛血清和DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后取出小室，以棉簽擦除小室聚碳酸酯膜上表面細(xì)胞和凝固的基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定 15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，倒置顯微鏡下觀察并任意選取5個(gè)視野(×20)計(jì)數(shù)聚碳酸酯膜下表面細(xì)胞，結(jié)果取均值。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測E-cad、N-cad、VDR蛋白表達(dá):取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，分別以含DCA 12.5 μmol/L的培養(yǎng)基處理 1、3、7、14、28 d，或以含DMSO的培養(yǎng)基處理28 d，收集細(xì)胞提取總蛋白，以Bradford法行蛋白定量。每一樣本取100 μg蛋白上樣，行10%變性SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入兔抗人E-cad抗體(1∶200)、鼠抗人N-cad抗體(1∶500)、兔抗人VDR抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶5000)，4℃過夜，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)或兔抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、HCT116細(xì)胞增殖率

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng) 12.5、50、200 μmol/L DCA作用36 h的 HCT116細(xì)胞，細(xì)胞增殖率較DMSO組明顯升高，以12.5 μmol/L組升高最為顯著(P＜0.05)(見圖1)。

二、HCT116細(xì)胞遷移力和侵襲力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)12.5 μmol/L DCA作用7 d的HCT116細(xì)胞，細(xì)胞遷移力較DMSO組明顯增強(qiáng)(見圖2);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該組細(xì)胞侵襲力亦較DMSO組顯著增強(qiáng)(P＜0.01)(見圖3)。

圖1 不同濃度、不同時(shí)間DCA處理組HCT116細(xì)胞增殖率比較

圖2 12.5 μmol/L DCA處理對 HCT116細(xì)胞遷移力的影響(劃痕實(shí)驗(yàn))

三、E-cad、N-cad、VDR 蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，DCA組E-cad和N-cad表達(dá)水平隨DCA作用時(shí)間的延長而升高，第28 d時(shí)明顯高于DMSO組;DCA組VDR表達(dá)水平在第1 d時(shí)較DMSO組有所上升，其后呈下降趨勢，第28 d時(shí)較DMSO組明顯降低(見圖4)。

圖 4 12.5 μmol/L DCA 處理對 HCT116 細(xì)胞 E-cad、N-cad、VDR表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

DCA是參與腸肝循環(huán)的次級(jí)膽汁酸，作為一種誘導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生的代謝產(chǎn)物，近年來在人群流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究方面得到廣泛關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)DCA可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，然而其在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用尚未明確。本研究以不同濃度DCA刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，證實(shí)DCA可促進(jìn)HCT116細(xì)胞增殖，濃度為12.5 μmol/L時(shí)效應(yīng)較 50、200 μmol/L 顯著，因此以12.5 μmol/L作為理想劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。本研究通過以DCA刺激HCT116細(xì)胞較長時(shí)間，探討DCA對HCT116細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響，結(jié)果顯示經(jīng)DCA作用7 d的HCT116細(xì)胞，細(xì)胞遷移力和侵襲力顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步以DCA作用于HCT116 細(xì)胞 1、3、7、14、28 d，研究 DCA 對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)標(biāo)記物E-cad、N-cad表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)水平隨DCA作用時(shí)間的延長而升高，第28 d時(shí)明顯高于DMSO組。E-cad是維系細(xì)胞間緊密連接的鈣連接蛋白，在EMT過程中表達(dá)減少或缺失，而N-cad在EMT過程中表達(dá)增加，該變化可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移［6］。然而有學(xué)者指出，細(xì)胞在經(jīng)歷EMT時(shí)，并非所有的EMT標(biāo)記物均會(huì)發(fā)生變化［7］。Nieman等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，在E-cad未發(fā)生明確變化的情況下，N-cad可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。Cho等［9］對肝細(xì)胞癌的研究顯示，N-cad不僅能促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲，還可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。由此可見，本研究中N-cad表達(dá)水平升高即可證實(shí)DCA對結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲具有促進(jìn)作用，而E-cad表達(dá)水平升高在此過程中的作用有待進(jìn)一步明確。

圖3 12.5 μmol/L DCA處理對HCT116細(xì)胞侵襲力的影響(Transwell實(shí)驗(yàn)，×20)

VDR是腸道上皮細(xì)胞的核受體之一，可通過抑制Wnt/β-catenin通路，阻止結(jié)直腸癌早期惡性演變，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用［10］。研究［11-12］顯示，約90%的結(jié)直腸癌患者存在VDR表達(dá)下調(diào)，低分化結(jié)直腸癌組織的VDR表達(dá)水平較高分化結(jié)直腸癌組織降低。EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1、SNAIL2可抑制VDR表達(dá)，而VDR可促進(jìn)E-cad表達(dá)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，DCA作用于HCT116細(xì)胞后，VDR表達(dá)水平呈雙向變化，在短時(shí)間內(nèi)(第1 d)呈上升趨勢，但3、7、14、28 d 后呈下降趨勢，推測DCA作用后VDR表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)升高可能是細(xì)胞為適應(yīng)并抑制DCA的毒性作用而產(chǎn)生的反應(yīng)性調(diào)節(jié)，但后期該調(diào)節(jié)作用減弱，VDR表達(dá)呈下降趨勢，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲。

綜上所述，DCA可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，且較長時(shí)間(7 d)的DCA刺激能顯著增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移力和侵襲力，其機(jī)制可能與上調(diào)N-cad表達(dá)和下調(diào)VDR表達(dá)有關(guān)，然而具體作用機(jī)制仍未完全明確，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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