田珺琪 ，張志廣 ，李 熳 ，劉 霞 ，張雪蓮 ，陸 偉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科，天津300211；2.天津市第二人民醫(yī)院消化科，天津 300192）

抗血小板藥物目前廣泛用于預(yù)防及治療心血管疾病，已經(jīng)逐漸成為臨床上用于治療血栓、栓塞的基石[1-3]。大量臨床研究已證實(shí)抗血小板治療對(duì)血栓栓塞性疾病一級(jí)和二級(jí)預(yù)防的益處[4]。但由于抗血小板藥物的廣泛應(yīng)用，其消化道不良事件也日益增多[5-7]。近年來(lái),隨著膠囊內(nèi)鏡和雙氣囊小腸鏡檢查的普及，越來(lái)越多的研究不再局限于其對(duì)胃的損傷，而開(kāi)始關(guān)注并已證實(shí)抗血小板藥物所致小腸損傷也不在少數(shù)。已有研究發(fā)現(xiàn)在使用非甾體類(lèi)抗炎藥 （non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）患者中，NSAIDs相關(guān)的小腸損傷程度甚至超過(guò)了胃損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在大鼠體內(nèi)研究抗血小板藥物對(duì)小腸的損傷，并探討可能機(jī)制，以期為臨床的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠80只（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房提供）；阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；氯吡格雷片（天津騰麟發(fā)展有限公司）；即用型SP免疫組化通用試劑盒（天津市津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠多克隆抗體TNF-α抗體、兔抗大鼠多克隆抗體IL-1β抗體（武漢博士得生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將80只大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。A組：陰性對(duì)照組；B組：阿司匹林組；C組：氯吡格雷組；D組：阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷組。

1.2.2 動(dòng)物造模 4組分別予以生理鹽水、阿司匹林10.41mg/kg、氯吡格雷7.81mg/kg、阿司匹林10.41mg/kg聯(lián)合氯吡格雷7.81mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)14 d,以上所有大鼠每次灌胃液體量均按10 mL/kg計(jì)算。造模期間大鼠均正常飲食飲水。

1.2.3 標(biāo)本制備 末次灌胃后所有大鼠禁食不禁水18 h，以10%水合氯醛3mL/kg行腹腔注射麻醉，分離全段腸系膜，沿腸系膜對(duì)側(cè)剖開(kāi)全部小腸，PBS沖洗干凈，觀察大鼠腹腔粘連情況及小腸損傷情況；于距回盲部40 cm處取近側(cè)端空腸1 cm，PBS沖洗干凈后，置4%甲醛液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4μm，行免疫組化檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白細(xì)胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）的表達(dá)。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.4.1 小腸黏膜大體觀察及損傷評(píng)分：沿腸系膜對(duì)側(cè)切開(kāi)小腸，PBS沖洗干凈后,于解剖顯微鏡下觀察，按照修改后的Reuter方法進(jìn)行小腸損傷情況評(píng)分。潰瘍?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未見(jiàn)明顯損傷為0分；局灶性充血，但未見(jiàn)潰瘍形成為1分；有潰瘍形成，但無(wú)充血及腸管增厚為2分；潰瘍形成伴炎癥反應(yīng)（1處）為3分；潰瘍形成伴炎癥反應(yīng)（2處及2處以上）為4分；出現(xiàn)穿孔為5分。粘連評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腸管無(wú)粘連計(jì)0分，輕度粘連（易解除）計(jì)1分,明顯粘連計(jì)2分。損傷總分為潰瘍?cè)u(píng)分與粘連評(píng)分之和。

1.2.4.2 免疫組化法檢測(cè)小腸黏膜TNF-α、IL-1β表達(dá)：采用SABC法（按試劑盒說(shuō)明書(shū)）。主要步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水、枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中低火修復(fù)抗原，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 15min，滴加一抗（TNF-α、IL-1β 均為 1∶200稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫1 h，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃溫箱中孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色3～4min，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。定性判定:（1）依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%,計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%,計(jì)1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%,計(jì)2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為51%～75%,計(jì) 3 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%,計(jì) 4 分；（2）依據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；褐色為3分；（3）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和著色強(qiáng)度兩項(xiàng)得分相加即為最后得分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，因各組樣本含量相等，故多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠小腸黏膜大體表現(xiàn)及損傷評(píng)分 對(duì)照組大鼠小腸組織未見(jiàn)明顯損傷；阿司匹林組可見(jiàn)腸管粘連、水腫，黏膜充血、糜爛、潰瘍；氯吡格雷組腸管粘連、水腫不明顯，黏膜可見(jiàn)少量散在點(diǎn)狀糜爛及小潰瘍；雙抗組腸管粘連、水腫、擴(kuò)張明顯，黏膜可見(jiàn)多處散在充血、糜爛及片狀潰瘍。各實(shí)驗(yàn)組損傷評(píng)分明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；阿司匹林組較氯吡格雷組損傷評(píng)分高（P＜0.01），雙抗組較阿司匹林組和氯吡格雷組損傷評(píng)分均明顯升高（P＜0.01）（表 1）。

表1 各組大鼠小腸黏膜損傷評(píng)分(x±s，n=20)Tab1 The injury scores of rats’sm all intestinalm ucosa in each group(x±s，n=20)

2.2 小腸黏膜TNF-α、IL-1β蛋白免疫組織化學(xué)染色 根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，TNF-α表達(dá)于細(xì)胞漿，呈黃色或棕黃色；IL-1β主要表達(dá)于細(xì)胞漿，呈黃色或棕黃色（圖1）。

2.3 小腸黏膜TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平 各實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜中TNF-α、IL-1β均較對(duì)照組呈顯著高水平表達(dá)（P<0.05），且阿司匹林組與氯吡格雷組相比呈高水平表達(dá)（P<0.05），雙抗組較單用阿司匹林、單用氯吡格雷亦呈明顯高水平表達(dá)（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠小腸黏膜TNF-α、IL-1β表達(dá)水平(x±s，n=20)Tab2 The expression levels of TNF-α and IL-1β in rats’small intestinalmucosa of each group(x±s，n=20)

4組之間分別兩兩比較TNF-α、IL-1β表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖1 各組大鼠小腸黏膜TNF-α（上）、IL-1β（下）表達(dá)Fig 1 Theexpressionsof TNF-α and IL-1β in rats’small intestinalmucosa of each group

3 討論

近年來(lái)抗血小板藥物在心腦血管疾病的治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，已成為心腦血管疾病的一級(jí)、二級(jí)預(yù)防藥物。多項(xiàng)大規(guī)模研究的結(jié)果證實(shí)阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的雙聯(lián)抗血小板治療可降低患者近期和遠(yuǎn)期的心血管風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其會(huì)增加患者出血、尤其是胃腸道出血的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。有研究表明，長(zhǎng)期服用阿司匹林的患者消化道潰瘍的發(fā)生率約為1%～2%[11]；聯(lián)合應(yīng)用阿司匹林和氯吡格雷可使消化道出血的風(fēng)險(xiǎn)增加7～14倍[12-13]。雖然目前對(duì)NSAIDs引起上消化道不良反應(yīng)的研究較多，但對(duì)阿司匹林和（或）氯吡格雷的雙抗或單抗治療與消化系統(tǒng)損傷的研究甚少，尤其是其所致的小腸損傷。

目前阿司匹林是臨床應(yīng)用最廣泛的抗血小板藥物，為NSAIDs的經(jīng)典代表，其對(duì)消化道的可能損傷機(jī)制包括:（1）局部作用，即其對(duì)消化道黏膜有直接的刺激作用，可作用于胃黏膜的黏液－碳酸氫鹽層，破壞胃黏膜的保護(hù)屏障；（2）全身作用，阿司匹林可使環(huán)氧合酶活性中心的絲氨酸乙酰化，抑制胃黏膜環(huán)氧合酶活性而使前列腺素（prostaglandin，PG）合成減少。而PG可以增加胃黏膜血流量，并刺激黏液和碳酸氫鹽的合成及分泌，促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，從而對(duì)胃黏膜起保護(hù)作用。氯吡格雷為新型抗血小板藥物，常與阿司匹林合用治療心腦血管疾病，是血小板表面二磷酸腺苷（adenosinediphosphate,ADP）受體拮抗劑,為不具抗血小板活性的前體藥物，其活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板聚集作用[14]，可抑制血小板釋放促血管生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而導(dǎo)致新生血管形成障礙，使胃腸受損傷黏膜修復(fù)受阻[15]。因此，認(rèn)為氯吡格雷不是潰瘍產(chǎn)生的直接原因，而是通過(guò)抑制血小板聚集及新生血管形成而阻礙潰瘍愈合，誘發(fā)已存在的無(wú)臨床癥狀的潰瘍出血。尚無(wú)確切證據(jù)表明氯吡格雷具有獨(dú)立的損傷胃腸道黏膜的作用。

隨著臨床上膠囊內(nèi)鏡和雙氣囊小腸鏡的廣泛應(yīng)用，抗血小板藥物對(duì)小腸的損傷逐漸受到關(guān)注。Lanas等[16]認(rèn)為NSAIDs所致的遠(yuǎn)端消化道損傷同樣常見(jiàn),甚至更加普遍。亦有研究發(fā)現(xiàn)外源性PGs并不能阻斷NSAIDs誘導(dǎo)的小腸損傷[17]，因此認(rèn)為NSAIDs相關(guān)小腸損傷的發(fā)生并不是單純通過(guò)抑制PGs合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

近年來(lái)炎癥反應(yīng)在小腸損傷中的作用逐漸受到廣泛關(guān)注。TNF-α是機(jī)體受內(nèi)外環(huán)境刺激后產(chǎn)生的具有重要生物學(xué)功能的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，參與機(jī)體的免疫、炎癥、抗感染等過(guò)程。單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞合成白細(xì)胞介素－1（interleukin－1，IL－l）前體，然后裂解產(chǎn)生成熟的具有生物活性的IL-1，按其結(jié)構(gòu)分IL-α和IL-1β兩種，其中IL-1β是重要的炎癥介質(zhì)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起重要作用。

我們用標(biāo)準(zhǔn)劑量阿司匹林、氯吡格雷灌服大鼠，免疫組化法測(cè)定TNF-α、IL-1β在大鼠小腸黏膜的表達(dá)，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜中TNF-α、IL-1β均較對(duì)照組呈顯著高水平表達(dá)，且阿司匹林組與氯吡格雷組相比呈高水平表達(dá)，雙抗組較單用阿司匹林、單用氯吡格雷組亦呈明顯高水平表達(dá)，這提示炎癥因子TNF-α、IL-1β參與了小腸黏膜的損傷，并在其發(fā)病機(jī)制中有一定意義。

綜上所述，筆者認(rèn)為阿司匹林、氯吡格雷致小腸損傷的前期機(jī)制可能不同，阿司匹林可主動(dòng)引起潰瘍形成，而氯吡格雷可能使血管形成受阻，導(dǎo)致已有潰瘍難以愈合，兩者最終均引起炎癥因子TNF-α、IL-1β不同程度地釋放，導(dǎo)致小腸黏膜損傷。但本實(shí)驗(yàn)僅在一定程度上說(shuō)明了炎癥反應(yīng)參與了抗血小板藥物所致大鼠小腸的損傷，而是否與其他損傷機(jī)制共同作用導(dǎo)致小腸損傷還有待進(jìn)一步研究。只有明確所有可能的損傷機(jī)制才有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)師更好地應(yīng)用抗血小板藥物并預(yù)防和治療相應(yīng)的消化道損傷。

[1]王海斌，鄒陽(yáng)春，郭敏.PCI術(shù)后雙聯(lián)抗血小板治療致上消化道出血的預(yù)防與治療[J].中國(guó)心血管病研究,2010,8(1):72

[2]陳章強(qiáng)，洪浪，王洪，等.雷尼替丁對(duì)冠心病患者介入術(shù)后雙重抗血小板治療所致消化道出血和血栓事件的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2010,13(32):3638

[3]馬玉真.冠心病患者抗血小板治療致上消化道事件分析與對(duì)策[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2012,7(25):91

[4]抗血小板藥物消化道損傷的預(yù)防和治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)組.抗血小板藥物消化道損傷的預(yù)防和治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí) (2012更新版)[J].中華內(nèi)科雜志,2013,52(3):264

[5]李熳，張志廣，盧向東，等.非甾體抗炎藥相關(guān)上消化道出血308例臨床特征分析[J].中華消化雜志,2013,33(5):342

[6]張志廣，陸偉，李熳，等.非甾體抗炎藥相關(guān)胃黏膜損傷機(jī)制的研究[J].中國(guó)綜合臨床,2013,29(4):358

[7]姚玉霞，徐寶宏，李靜，等.雙重抗血小板治療并發(fā)上消化道出血72例[J].臨床薈萃,2012,27(3):224

[8]Adebayo D,Bjarnason I.Is non-steroidal anti-inflammaory drug(NSAID)enteropathy clinically more important than NSAID gastropathy[J].Postgrad Med J,2006,82(965):186

[9]Potsis T Z,Katsouras C,Goudevenos JA.Avoiding and managing bleeding complications in patientswith non-ST-segmentelevation acutecoronarysyndromes[J].Angiology,2009,60(2):148

[10]秦素蓮.抗栓藥治療致上消化道出血的臨床分析[J].吉林醫(yī)學(xué),2013,34(6):1067

[11]Khalique SC,Cheng-Lai A.Drug interaction between clopidogrel and proton pump inhibitors[J].CardiolRev,2009,17(4):198

[12]MoayyediP,SadowskiDC.Proton pump inhibitors and clopidogrel-hazardous drug interaction or hazardous interpretation of data[J].Can JGastroenterol,2009,23(4):251

[13]Cryer B.Management of patientswith high gastrointestinal risk on antiplatelet therapy[J].Gastroenterol Clin North Am,2009,38(2):289

[14]Mega JL,Close SL,WiviottSD.Cytochrome P-450 polymorphisms and response to clopidogrel[J].NEngl JMed,2009,49(4):1083

[15]BhattD L,Scheiman J,Abraham N S,etal.ACCF/ACG/AHA 2008 expert consensus documenton reducing the gastrointestinal risksof antiplatelet therapy and NSAID use:a reportof the American College of Cardiology Foundation Task Force on Clinical Expert ConsensusDocuments[J].Circulation,2008,118(18):1894

[16]Lanas A,Scarpignato C.Microbial flora in NSAID-induced intestinal damage:a role for antibiotics[J].Digestion,2006,73(Suppl 1):136

[17]Playford R J,Floyd DN,Macdonald CE,etal.Bovine colostrum isa health food supplementwhich prevents NSAID induced gutdamage[J].Gut,1999,44(5):653