何廣輝，孫豐源

（1.天津市眼科醫(yī)院玻璃體視網(wǎng)膜中心，天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院，天津300040；2.天津市第一中心醫(yī)院眼科，天津 300192）

白藜蘆醇(resveratrol，Res)于1940年首次從毛葉藜蘆的根部提取獲得，它廣泛存在于虎杖、葡萄等21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中[1]，是一種天然活性成份。從19世紀(jì)70年代至今，大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇具有抗腫瘤活性，對(duì)腫瘤的起始、促進(jìn)、發(fā)展3個(gè)主要階段均有抑制作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)選取B淋巴細(xì)胞來源的BJAB細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）比較不同作用濃度及作用時(shí)間的Res對(duì)BJAB細(xì)胞增殖的影響，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）分析Res對(duì)BJAB細(xì)胞周期的影響，為其作為抗B細(xì)胞淋巴瘤藥物的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 BJAB細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室楊潔教授惠贈(zèng)。Res由南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。MTT、青霉素、鏈霉素、碘化丙啶購自Sigma公司。RPMI-1640干粉、PBS干粉、二甲基亞砜購自GIBCO公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱（SANYO），倒置相差顯微鏡（NIKON），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）,Milli-Q超純水系統(tǒng)，恒溫烤箱（格蘭仕），酶標(biāo)測(cè)定儀（BIO-RAD），臺(tái)式低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），低溫冰箱（SANYO），低溫高速離心機(jī)（HITACHI），分析天平（BOSCH），24孔及 96孔培養(yǎng)板（Cellstar），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（GLOSTAR），流式細(xì)胞儀（COWTER）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組加入不含Res、無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組分為6組，分別加入含終濃度為5、10、25、50、75、100μg/mL的Res，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 MTT法檢測(cè)Res對(duì)BJAB細(xì)胞增殖的影響

BJAB細(xì)胞以103/孔接種于96孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液200μL培養(yǎng)48h,然后換為無血清無雙抗的培養(yǎng)液200μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度Res的培養(yǎng)液200μL，空白組加無血清的培養(yǎng)液200μL，分別作用24、48、72 h，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)及空白組常溫低速離心（800 r/min）5min后吸出上清液100μL，然后加入20μLMTT液，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后，加入150μLDMSO，室溫下于微量振蕩器上振蕩5min，于570 nm測(cè)定各孔OD值。計(jì)算不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率（IR）。IR%=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%[7]。

1.2.3 FCM檢測(cè)Res對(duì)BJAB細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞培養(yǎng)及加藥過程同前，分別收集實(shí)驗(yàn)組25、50、100μg/mLRes作用 24 h和 50μg/mLRes作用24、48、72 h的BJAB細(xì)胞以及對(duì)照組BJAB細(xì)胞，每份加冷PBS洗滌離心2次，然后加預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。次日棄去乙醇后，PBS洗滌離心，棄去上清液，每份樣本加0.2mLPBS，將細(xì)胞輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，加入0.5mLPI染液，40℃避光染色30min，488 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞比例及增殖指數(shù)[PI=（S＋G2）/（G1＋S＋G2）][8-9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，進(jìn)行組間單因素方差分析。樣本率之間的統(tǒng)計(jì)分析用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變 不同濃度藥物作用后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度有所下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，部分細(xì)胞體積縮小，呈小圓形，部分細(xì)胞呈梭形，核仁不清晰，胞質(zhì)不勻，隨著濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目減少，并且多數(shù)細(xì)胞呈梭形。隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度降低，細(xì)胞不同程度呈現(xiàn)出核固縮、核碎裂、核溶解等凋亡特征（圖1～3）。

圖1 25μg/m L Res作用24 h后BJAB細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（×200）Fig 1 M orphology changeof BJAB cellaffe cted by 25 μg/m L Res for 24 h（×200）

圖2 50μg/m L Res作用24 h后BJAB細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200）Fig 2 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 24 h

圖3 50μg/m L Res作用48 h后BJAB細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（×200）Fig 3 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 48 h

2.2 MTT法測(cè)定Res對(duì)BJAB細(xì)胞的抑制作用見表1。

表1 不同濃度藥物組作用不同時(shí)間后的OD值（x±s，n=6）Tab1 OD value of different durations and densities of Res on BJAB（x±s，n=6）

不同濃度的Res作用于BJAB細(xì)胞24、48、72 h，均可不同程度地抑制細(xì)胞的增殖。其中5μg/mLRes與對(duì)照組比較，在24 h作用不明顯，而其余各濃度組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，對(duì)細(xì)胞都有明顯的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果可見，Res對(duì)BJAB細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性（圖4）

圖4 不同濃度Res對(duì)BJAB作用不同時(shí)間的抑制率Fig 4 Inhibition ratio of different durationsand densitiesof Reseffected on BJAB

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Res對(duì)BJAB細(xì)胞周期的影響 以濃度為 0、25、50、100μg/mL處理細(xì)胞 24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BJAB細(xì)胞周期，結(jié)果見表2?？梢婋S著Res濃度增大，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，而S、G2期的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，計(jì)算增殖指數(shù)可見，隨著用藥濃度增大而BJAB細(xì)胞增殖指數(shù)呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。

表2 不同濃度Res作用24 h對(duì)BJAB細(xì)胞周期的影響Tab2 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different densitiesof Res for 24 h

用 50μg/mL Res分別處理 BJAB細(xì)胞 0、24、48、72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示隨著Res作用時(shí)間延長(zhǎng)，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，而S、G2期的細(xì)胞百分比逐漸減少（表3）。

表3 50μg/m L Res在不同作用時(shí)間對(duì)BJAB細(xì)胞周期的影響Tab3 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different durationsof 50μg/m L Res

3 討論

Res化學(xué)名 3，5，4-三羥基芪 (3，5，4-trihydroxystilbene），是一種植物防御素（phytoalexin），具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝血、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)等[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Res在抗腫瘤方面具有較好的效果，其抗腫瘤作用機(jī)制主要體現(xiàn)在以下各方面：（1）防止正常細(xì)胞癌變[12-13]：抑制細(xì)胞色素P450 1A1（CYP 1 A1）；抑制環(huán)氧酶(COX)；抗氧化損傷。（2）抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14-15]：抑制DNA復(fù)制過程的關(guān)鍵酶；拮抗雌激素；改變自分泌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子；抑制腫瘤細(xì)胞自分泌活性氧。（3）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[16-17]：作用于細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶而致凋亡；通過p53引發(fā)凋亡；影響bcl-2家族誘導(dǎo)凋亡；通過線粒體介導(dǎo)凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度及長(zhǎng)時(shí)間Res作用可使BJAB細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞體變?yōu)樗笮?，兩極尖細(xì)，胞質(zhì)渾濁，核固縮，甚至消失，胞間增寬，細(xì)胞碎片增多。5μg/mLRes在短時(shí)間內(nèi)對(duì)BJAB細(xì)胞增殖抑制作用不明顯，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，可顯著抑制BJAB細(xì)胞的增殖（P<0.05），而25、50、75、100μg/mL 組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，對(duì)細(xì)胞都有明顯地抑制作用（P<0.01）。同一濃度的藥物隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸加強(qiáng)，表明Res對(duì)BJAB細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴性。而同一時(shí)間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，抑制作用也增強(qiáng)，表明Res對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。

Jazirehi等[18]認(rèn)為，Res可以抑制非霍奇金淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增生，并促進(jìn)其凋亡，原因在于Res可以使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停留在G1期，此外，Res還可以選擇性地下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL和骨髓細(xì)胞分化因子1（Mcl-1），并可以上調(diào)凋亡前體蛋白Bax和凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)用不同濃度的Res處理細(xì)胞24 h后，用FCM檢測(cè)BJAB細(xì)胞周期，可發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度增大BJAB細(xì)胞G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，而S、G2期的細(xì)胞逐漸減少，并且隨著用藥濃度增大而BJAB細(xì)胞增殖指數(shù)呈下降趨勢(shì)。用50μg/mLRes分別處理BJAB細(xì)胞0、24、48、72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示隨著Res作用時(shí)間延長(zhǎng)BJAB細(xì)胞G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，而S、G2期細(xì)胞逐漸減少。

Res對(duì)BJAB細(xì)胞的作用可能涉及多種機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Res直接抑制BJAB細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致其產(chǎn)生細(xì)胞周期的改變。本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平上觀察了Res對(duì)BJAB細(xì)胞的作用，有待進(jìn)一步在分子及蛋白質(zhì)水平研究其作用機(jī)制，并且需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)Res針對(duì)淋巴瘤動(dòng)物模型治療的有效性和安全性，將這一相對(duì)經(jīng)濟(jì)、有效、低副作用的植物活性成分應(yīng)用于淋巴瘤患者的臨床治療。

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