吳咚咚 王強 蔡慧慧 施潔瑩 付惠玲 王新全 周育 丁林賢

摘要 [目的]探索降解毒死蜱的新的微生物資源。[方法]應用最大或然數(shù)（MPN）法，通過添加適量復蘇促進因子（Rpf）從多種土壤及污水生物處理系統(tǒng)中分離活的非可培養(yǎng)（VBNC）資源菌種，根據(jù)文獻報道的已知毒死蜱降解菌株的系統(tǒng)關系綜合分析，初步篩選出與已知降解毒死蜱菌種近緣的VBNC菌株并進行降解試驗。[結果]共篩選出6株具有毒死蜱降解能力的菌株，其中菌株CHZYR63對毒死蜱的生物降解能力最強，經(jīng)Box-behnken響應面法優(yōu)化后降解率可達70.15%。[結論]可培養(yǎng)化VBNC菌種資源在殘留農(nóng)藥降解方面有較大的利用價值，為揭示受染環(huán)境中VBNC微生物的形成及其活性化、環(huán)境污染物質(zhì)的共代謝等微生物群體的相互作用機制提供了參考。

關鍵詞 Rpf;VBNC;毒死蜱;生物降解;響應面法

中圖分類號 S182;X172 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11711-04

Research on Viable but Non-culturable Bacteria in Chlorpyrifos Degradation

WU Dong-dong1，WANG Qiang2，CAI Hui-hui1，DING Lin-xian1* et al

（1. College of Geography and Environmental Science，Zhejiang Normal University，Jinhua， Zhejiang 321004;2. Institute of Quality and Standard for Agro-products， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou， Zhejiang 310000）

Abstract [Objective] The aim was to explore new microbial resources to degrade Chlorpyrifos. [Method] Using MPN system， some strains of the VBNC（viable but non-culturable）bacteria which could degrade Chlorpyrifos were isolated from soil and sewage biological treatment system through adding with some Rpf （resuscitation promoting factor）. [Result] Total six strains of the VBNC were obtained， among them the biodegradability of strain CHZYR63 could reach 70.15% through the analysis of Box-behnken response surface method. [Conclusion] The culturable VBNC bacteria not only have great value in degrading pesticide residues，but also provide important ideas and methods on revealing the formation mechanism and recovery mechanism of VBNC bacteria in polluted environment and total metabolism of environmental pollutants and interaction mechanism of the microbial population.

Key words Resuscitation promoting factor; Viable but non-culturable bacteria; Chlorpyrifos; Biodegradation; Response surface method

基金項目 國家高技術研究發(fā)展計劃（863）項目（2011AA100806）;國家自然科學基金項目（31340071）;浙江省自然科學基金項目（LY13C010002）。

作者簡介 吳咚咚（1986-），男，浙江蒼南人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物技術。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事環(huán)境微生物研究。

鳴 謝 試驗過程中，得到日本東京大學分子與細胞生物學研究所橫田明教授提供的Micrococcus luteus菌種，在此致謝！

收稿日期 2014-10-09

利用純培養(yǎng)技術從土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物等自然界中分離到的微生物只占微生物總數(shù)的0.01%～10.00%，尚有90%以上的微生物處于未培養(yǎng)或活的但非可培養(yǎng)[1]狀態(tài)而未被廣泛認知。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，多種分子生物學研究方法為認識更多的VBNC狀態(tài)菌提供了可能[2]。非培養(yǎng)手段雖可獲取大量的有關微生物多樣性及菌群的組成信息，但微生物相關生物學以及生態(tài)學功能的研究仍然受到許多限制。因此，應用Rpf[3]分離培養(yǎng)作為絕大部分微生物資源的VBNC狀態(tài)菌及探索其潛在的相關功能，將為重新認識和評價微生物在食品發(fā)酵、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領域的作用提供新的科學依據(jù)，賦予其更廣闊的開發(fā)應用前景[4-5]。面對日益嚴重的有機磷農(nóng)藥（尤其是毒死蜱等持久性污染物） 污染問題，研究污染物脅迫下細菌進入VBNC狀態(tài)的生存機制、關注VBNC 狀態(tài)菌的可培養(yǎng)化，特別是其潛在環(huán)境功能的研究，將為受污環(huán)境的微生物修復開拓新的應用前景[6]。

毒死蜱是目前全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑品種之一，也是世界衛(wèi)生組織唯一許可的有機磷品種，現(xiàn)已在我國、美國、澳大利亞、日本等14個國家登記和注冊[7]。毒死蜱在我國產(chǎn)銷量逐年增加而且使用范圍不斷擴大，隨之而來的毒死蜱生產(chǎn)和使用過程中帶來的環(huán)境壓力已不能忽視，其主要特點是在自然環(huán)境中的半衰期較長，為10～120 d，其中間體之一的三氯吡啶醇鈉（TCP）具有抑菌活性，為生物難降解物質(zhì)，易在農(nóng)作物和蔬菜中殘留，從而對人體造成損害[8]。2000年，美國環(huán)境保護局（EPA）指出毒死蜱可能對人的神經(jīng)系統(tǒng)和腦部發(fā)育有潛在傷害，對兒童健康不利，宣布禁止在美國家庭和庭院內(nèi)使用毒死蜱，并同時減少它在其他領域的使用[9]。因此，如何有效地應對毒死蜱的毒性和殘留帶來的污染，成為當前亟待解決的問題。由于毒死蜱特殊的化學結構和代謝產(chǎn)物TCP，傳統(tǒng)的物理、化學、物理化學處理法及其綜合利用均因存在低效以及二次污染問題限制了其在毒死蜱污染環(huán)境修復中的應用[10]。國內(nèi)外研究表明，微生物降解治理技術安全、高效、經(jīng)濟，生物降解是控制和去除毒死蜱殘留的有效途徑之一。毒死蜱作為有機磷水解酶難以作用的一種底物，屬于難以生物降解的物質(zhì)，因此，分離篩選具有真正高效降解能力的微生物難度較大。隨著毒死蜱的大量生產(chǎn)和廣泛使用，其污染也勢必會越來越嚴重，分離篩選和構建高效毒死蜱降解菌成為修復毒死蜱污染環(huán)境的關鍵所在[11]。為此，筆者基于在多種土壤及污水生物處理系統(tǒng)中利用MPN體系，添加適量Rpf[3]從中分離取得VBNC資源菌種，根據(jù)文獻報道的已知毒死蜱降解菌株的系統(tǒng)關系綜合分析，初步篩選了與已知降解毒死蜱菌種近緣的VBNC菌株并進行了降解試驗，以期為降解毒死蜱提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試菌株。分離自沙漠極限環(huán)境土壤、制藥、印染以及城市污水處理系統(tǒng)中的可培養(yǎng)化VBNC菌株。

1.1.2

主要試劑與儀器。

99.8%毒死蜱標品（Sigma公司）、48%毒死蜱乳油（陶氏公司）、Rpf（實驗室制備）、正己烷（分析純）、甲醇（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純）等試劑。儀器包括高速冷凍離心機（5430R，Eppendorf公司）、電子天平（BSA822-CW，Sartorius公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9240，上海精宏實驗設備有限公司）、立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋（LS-B50L，上海醫(yī)用核子儀器廠）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160，上海精宏實驗設備有限公司）、恒溫搖床（YG-B，江蘇太倉實驗設備廠）、精密pH計（pH-3B，上海雷磁儀器廠）、酶標儀（1510，Thermo公司）、紫外分光光度計（Spectrum-1920）和Labsolution GC-2000氣相色譜分析（日本島津公司）。

1.1.3

培養(yǎng)基。富營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母3.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g， 2%瓊脂，pH7.0，定容至1 L。

唯一磷源培養(yǎng)基：NaCl 1.0 g，（NH4）2NO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，定容至1 L。

唯一碳源培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，（NH4）2NO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，pH7.0，定容至1 L。無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，NH4NO3 1.5 g，pH7.0，定容至1 L。

少量碳源培養(yǎng)基：K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，NH4NO3 1.5 g，加1%酵母抽提液，pH7.0，定容至1 L。

毒死蜱（定量）溶于正己烷（定量），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并滅菌后加入培養(yǎng)基中（終濃度）。

1.2 方法

1.2.1

VBNC菌的分離和純化。

采用MPN法，設計培養(yǎng)基中含Rpf的處理組與不含Rpf的對照組，以10倍稀釋梯度以及重復3次構建MPN培養(yǎng)系，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)4～5 d，肉眼觀察培養(yǎng)基有無混濁，并用酶標儀測定渾濁培養(yǎng)液的OD值。根據(jù)稀釋段的渾濁情況，查對MPN值表，計算單位樣品中處理組與對照組的可培養(yǎng)化細菌總數(shù)，判斷Rpf對VBNC細菌的復蘇生長作用。然后對判斷為Rpf有效的處理組渾濁培養(yǎng)液進行稀釋平板涂布分離，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取單菌落獲得純化的菌株。將純化得到的細菌進行擴大培養(yǎng)，并用10%甘油將菌液冷凍在-80 ℃下保存。

1.2.2

毒死蜱的定量與降解菌降解能力的測定。

1.2.2.1

毒死蜱氣相色譜條件的設置。進樣口溫度為 300 ℃;烘箱溫度為程序升溫：起始溫度180 ℃，保留2 min，然后以 10 ℃/min的速率升至280 ℃，保留10 min;ECD 檢測器溫度330 ℃;載氣為N2，柱流速為 19.9 ml/min;進樣量：1 μl;分流比7∶1。

1.2.2.2

毒死蜱定量方法的確定。

設置3個獨立重復試驗， 每個重復試驗在相同的培養(yǎng)條件下進行，采用正己烷作為萃取劑，在樣品中加入等體積的正己烷，手動振蕩將二者充分混勻，然后靜置1 h，待有機相和水相完全分離后，進行毒死蜱萃取，取出上層的有機相溶液，重復萃取1次，合并提取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后（真空冷凍近干，再用氮吹，重溶于等體積正己烷中）用0.22 μm濾膜過濾，使用紫外分光光度計（293 nm）和氣相色譜確定毒死蜱的殘留量及其降解率。

1.2.2.3

可培養(yǎng)化VBNC菌對毒死蜱降解能力的測定。

將細菌從斜面接種到平板（固體營養(yǎng)培養(yǎng)基、唯一磷源培養(yǎng)基、唯一碳源培養(yǎng)基、少量碳源培養(yǎng)基），30 ℃下培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基（5 ml），30 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取60 μl培養(yǎng)液，加入5 ml毒死蜱含量為100 mg/L的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。檢測毒死蜱的殘留含量。

1.2.3

響應面設計。

響應面法（RSM）能夠?qū)τ绊懡到庑实囊蜃铀郊捌浣换プ饔眠M行優(yōu)化與評價[12]，從而在各因素水平的響應值基礎上找出預測的響應最優(yōu)值以及相應的試驗條件[13-14]。該試驗運用Design-Expert8.0軟件中的Box-behnken Design（BBD）程序進行響應面設計，以確定菌株CHZYR63（Pseudomonas fluorescens）降解毒死蜱的最優(yōu)條件。具體因素及水平設計見表1。

表1 Box-behnken試驗設計

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度計法測定毒死蜱殘留

用正己烷配制一系列濃度的毒死蜱溶液：5、10、20、30、40、50、60、80、100、140 mg/L;用紫外分光光度計（293 mn）測定并計算毒死蜱含量。毒死蜱濃度與相應吸光度的線性回歸方程為y=0.017 7x+0.003 2，相關系數(shù)R2=0.998 5 （圖1）。

圖1 毒死蜱在正己烷中的標準曲線

在普通培養(yǎng)基中分別添加5、50、100 mg/L的毒死蜱，然后對普通培養(yǎng)基中的毒死蜱進行萃取回收試驗，利用紫外分光光度計對毒死蜱含量進行檢測，每個濃度進行3個平行試驗。

從表2可知，毒死蜱的回收率隨添加濃度的增加而減少，普通培養(yǎng)基中的回收率范圍是95.7%～118.0%，相對標準偏差在5.4%～6.7%[9]。試驗結果表明，分析方法的準確度和精密度能夠滿足菌株降解農(nóng)藥殘留分析的要求。因此，上述無機鹽培養(yǎng)基中毒死蜱的檢測方法符合農(nóng)藥殘留分析標準的要求，可用于毒死蜱的定量試驗中。

表2 毒死蜱在培養(yǎng)液中的添加回收率

2.2 氣相色譜法測定毒死蜱殘留量

用正己烷配制一系列標準濃度的毒死蜱溶液：5、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L;然后在“1.2.2.1”氣相色譜條件下測定毒死蜱含量。毒死蜱濃度與相應吸光度的線性回歸方程為y=24 203x+612 212，相關系數(shù)R2=0.995 3（圖2）。

圖2 毒死蜱GC-ECD標準曲線

2.3 可培養(yǎng)化VBNC菌株的初步篩選

2.3.1

毒死蜱降解性菌株的初步篩選。分別從多種土壤、印染和制藥以及城市污水處理系統(tǒng)中分離到數(shù)十株可培養(yǎng)化VBNC菌株，經(jīng)檢索初步篩選出與已知降解毒死蜱關聯(lián)菌種近緣的VBNC菌種14株作為試驗菌株（表3）。

表3 已知降解毒死蜱關聯(lián)菌種近緣的VBNC菌種

注：表中可培養(yǎng)化VBNC菌株的分離源均為制藥污水。

2.3.2

菌株在不同培養(yǎng)基中的降解能力。結果表明，CHZYN52在少量碳源培養(yǎng)基中的降解率最高，為70.48%，而CHZYN63在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中降解率最高，為61.48%，唯一磷、碳培養(yǎng)基中各菌株降解率均較低（圖3）。

圖3 菌株在各培養(yǎng)基下的降解率

2.3.3

響應面分析及結果。

根據(jù)試驗設計表得到17組不同的試驗組合，分別對該17組試驗進行毒死蜱降解效率的測定，得到每個試驗的毒死蜱降解率值（表4），并對結果進行方差分析及二次多項回歸擬合。

表4 Box-Behnken 試驗結果

結果表明， 模型Prob>F 值小于0.05，說明該模型顯著。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，模型失擬項的Prob>F 值小于0.01，模型的相關系數(shù)R2=0.991 8，校正系數(shù)RAdj2=0.985 5，說明該模型比較合適[20]。經(jīng)軟件分析得到毒死蜱降解率對農(nóng)藥濃度、溫度和pH的多元回歸方程：

Y=55.82+13.39A-6.44B+10.63C+1.84AB+9.58AC+6.57BC-30.71A2-12.27B2-11.17C2

為了進一步研究相關變量之間的交互作用并確定其最優(yōu)點， 用Design-Expert 軟件繪制2個關鍵影響因素對毒死蜱降解交互影響的曲面圖。從圖4可知，毒死蜱降解率達到預測最大值時的條件為：毒死蜱濃度131 mg/L，pH9.0，培養(yǎng)溫度29 ℃，預測最高降解率可達68.00%。

圖4 毒死蜱濃度和pH交互作用的響應面

將菌株CHZYR63接種到含有131 mg/L毒死蜱的pH為9的富營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在29 ℃下進行培養(yǎng)。經(jīng)測定培養(yǎng)基中毒死蜱的濃度變化可知，菌株CHZYR63對毒死蜱的降解率可達到70.15%。試驗驗證該設計方法切實可行，條件優(yōu)化后的毒死蜱的降解率為70.15%，與模型預測值相當接

近。VBNC菌株對毒死蜱的降解能力尚未見相關報道。通過BBD響應面法試驗設計，優(yōu)化CHZYR63菌株對毒死蜱的降解條件，通過降解特性研究，可以得知培養(yǎng)7 d后，CHZYR63菌株在29 ℃、pH為9、毒死蜱初始濃度為131 mg/L的最適條件下，對毒死蜱的降解率可達70.15%。結果表明，毒死蜱降解條件的優(yōu)化能夠促進可培養(yǎng)化VBNC菌株CHZYR63對毒死蜱的生物降解，提高毒死蜱的降解效率。

3 討論

試驗應用Micrococcus luteus所分泌的Rpf從多種環(huán)境中分離到經(jīng)復蘇活化的可培養(yǎng)化VBNC菌種，初次從VBNC菌中篩選到6株具有降解毒死蜱能力的菌株：CHZYN52、ZYSR62、CHZYR63、CHZYR61、CHZYR52和ZYSR66，分別屬于Pseudomonas putida、Agrobacterium albertimagni、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas stutzeri、Moraxella osloensis、Agrobacterium tumefaciens的近緣菌種。其中以屬于Pseudomonas fluorescens的菌株CHZYR63具有較高的降解效果，顯示出可培養(yǎng)化VBNC菌種的實際應用價值。因此，基于環(huán)境功能及微生物資源角度，展開Rpf 復蘇VBNC狀態(tài)菌的研究，對于尋找新的菌種資源及潛在的環(huán)境功能菌群具有重要意義，同時為重新認識和評價微生物在污染環(huán)境修復、環(huán)境保護領域的作用提供新的理論依據(jù)。

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