劉敏瑞 李瑞琴 倪永清

摘要 [目的] 篩選并分析天山一號冰川冰層產(chǎn)淀粉酶的低溫酵母菌。[方法] 對天山一號冰川冰層含冰凍土產(chǎn)低溫淀粉酶的低溫酵母菌菌株進(jìn)行篩選、純化，并對其生理多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究。[結(jié)果]從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離出60株酵母菌，并從中篩選出6株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株，根據(jù)細(xì)胞菌落形態(tài)、菌體特征和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析，6株菌分別隸屬于紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球菌屬（Cryptococcus）和擲孢酵母屬（Sporobolomyces），最適生長溫度為20～24 ℃，為兼性耐冷細(xì)菌。[結(jié)論]研究可為了解冰川酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性以及低溫淀粉酶的生物技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 天山冰川；酵母菌；低溫淀粉酶；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號 S181+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-11095-02

Phylogenic Analysis of Coldadapted Yeasts Producing Amylase from Permafrost of the Glacier No. 1 in the Tianshan Mountains

LIU Minrui， LI Ruiqin， NI Yongqing*

（College of Food Science， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract [Objective] To screen and analyze coldadapted yeasts producing amylase from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains. [Method] The screening and purification were conducted， physiological diversity and phylogenetic diversity were studied. [Result] The coldadapted amylaseproducing strains of yeasts was isolated from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains. Among 60 selected and purified strains of yeasts， only 6 isolates were coldadapted amylaseproducing strains by using the screening media containing starch. Based on their phenotypes and 26S rDNA gene D1/D2 sequences， 6 coldadapted amylaseproducing strains of yeasts belonged to 3 genera Rhodotorula， Cryptococcus and Sporobolomyces. Six isolates producing amylase showed the optimal growth temperature ranging from 20 ℃ to 24 ℃， indicating that they were psychrotrophic. [Conclusion] The results enrich our knowledge on the phylogenetic and physiological diversity of coldadapted strains of yeasts producing amylase in cold environments.

Key words Tianshan Mountains； Yeast； Coldadapted amylase； Bacterial phylogeny

地球生物圈3/4屬于永久低溫環(huán)境，包括南北兩極及環(huán)極地地區(qū)、深海海水、高原高山地區(qū)^[1]。低溫環(huán)境中微生物分泌的胞外酶在中、低溫度下具有較高催化活性，在工農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值^[2]。因此，低溫微生物及低溫酶的冷適應(yīng)機(jī)制研究成為當(dāng)前的一個熱點。淀粉酶是水解淀粉及糖原的酶類總稱^[3]，是重要的工業(yè)用酶，應(yīng)用于食品、洗滌、飼料、制藥、紡織和造紙等工業(yè)。低溫淀粉酶在生物工程領(lǐng)域及解決現(xiàn)代能源危機(jī)中有著廣泛的應(yīng)用前景。目前，國外主要針對南極冰川可培養(yǎng)的低溫酵母菌多樣性的研究較多^[4]，但對酵母菌產(chǎn)酶性能的研究較少。我國關(guān)于低溫酵母菌及其產(chǎn)淀粉酶的研究報道大多來自海洋深水處^[5]，對其他冷生境中酵母菌的研究很少。筆者對天山一號冰川冰層含冰凍土產(chǎn)低溫淀粉酶的低溫酵母菌菌株進(jìn)行篩選、純化，并對其生理多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究，為低溫淀粉酶在工農(nóng)業(yè)及食品生物技術(shù)各領(lǐng)域的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。凍土樣品于2012年9 月采自天山一號冰川西支的冰川尾部，海拔3 833 m（43°07.125N，86°48.707E）。

1.1.2 主要試劑。PCR 擴(kuò)增所用全套試劑、引物均購自TaKaRa 公司，其余試驗所用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器。PCR 擴(kuò)增儀 Tpersonal，德國 Biometra；水平電泳儀 PowerPac Universal，德國 BioRad；凝膠成像系統(tǒng)Gel DocTM XR，德國 BioRad；紫外-可見光分光光度計Ultrospec 5300 pro，美國 GE Healthcare。

1.1.4 培養(yǎng)基。

分離培養(yǎng)基RB（Rose Bengal agar）+ tetracycline 培養(yǎng)基^[6]，瓊脂1.5%；液體富集培養(yǎng)基YEPG（酵母提取物10 g/L，peptone 10 g/L，葡萄糖20 g/L）；基礎(chǔ)培養(yǎng)基YEPG（酵母提取物10 g/L，peptone 10 g/L，葡萄糖20 g/L），瓊脂粉1.5%；選擇培養(yǎng)基（酵母提取物10 g/L，peptone 10 g/L，可溶性淀粉2%），瓊脂粉1%；以上培養(yǎng)基pH均為6.8，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的分離與純化

富集培養(yǎng)，10 ℃培養(yǎng)48 h，使菌種增殖。采用梯度稀釋平板涂布法于分離培養(yǎng)基上進(jìn)行分離。10 ℃培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3次后，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)等表型差異進(jìn)行初步分離篩選并純化，所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPG 基礎(chǔ)斜面培養(yǎng)基上，編號，4 ℃保藏備用。

1.3 產(chǎn)低溫淀粉酶菌株篩選

在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的低溫菌株，24 ℃培養(yǎng)3 d后在培養(yǎng)基表面分別滴加稀碘液，觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。

1.4 菌株最適生長溫度測定

將6株產(chǎn)淀粉酶酵母菌株接入YEPD 液體富集培養(yǎng)基（pH為6.0）中，分別在16、20、24、28、37 ℃ 5個溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后600 nm 測OD值。

1.5 26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析

提取單菌落的DNA，采用酵母菌26S rDNA 基因通用引物NL1 和NL4擴(kuò)增26S rDNAD1/D2 區(qū)基因片段^[7]。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，36次循環(huán)（94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用EZ10 column PCR Product Purification kit純化后，由上海生工生物科技有限公司直接測序。所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列搜索，CLUSTAL X 1.83 軟件對齊序列，采用鄰接法neighborjoining和MEGA4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分支的置信度采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000^[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化及產(chǎn)酶菌株的篩選結(jié)果

從天山一號冰川冰層含冰凍土中共分離純化到60株酵母菌菌株，從中篩選到6株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株，編號分別為C9、L1、L15、L18、L27、L34。

2.2 菌種形態(tài)與菌體特征鑒定結(jié)果

篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察其菌落形態(tài)和菌體特征，結(jié)果如表1。

3 討論

淀粉酶廣泛存在于動物、植物和微生物中^[10]，是一類非常重要的工業(yè)用酶，目前國內(nèi)外市場中常用的淀粉酶一般都是中溫或高溫淀粉酶，最適酶活溫度一般都在50 ℃左右，在0～20 ℃低溫范圍活力很低^[11]，不適于食品、飼料、紡織和洗滌劑、制藥等低溫處理的條件而限制其應(yīng)用，但低溫淀粉酶的最適酶活溫度一般在40 ℃以下，因此其很好地解決了這一難題，具有中、高溫淀粉酶無法取代的優(yōu)越性。該試驗從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離、純化出60株酵母菌菌株，篩選出6株產(chǎn)低溫淀粉酶的酵母菌菌株，并對所分離的菌株進(jìn)行較系統(tǒng)的分類鑒定，為低溫淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論和實踐基礎(chǔ)，以解決酶來源的問題。到目前為止，盡管文獻(xiàn)報道低溫淀粉酶比中溫酶有許多的優(yōu)勢，但低溫酶生物技術(shù)的應(yīng)用開發(fā)并不成熟，針對于冷環(huán)境中微生物資源的開發(fā)，還需在培養(yǎng)方法和技術(shù)上取得突破^[2]。

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