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        天山一號冰川產(chǎn)淀粉酶酵母菌的篩選及其系統(tǒng)發(fā)育分析

        2014-10-21 00:29:19劉敏瑞李瑞琴倪永清
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年31期
        關(guān)鍵詞:酵母菌

        劉敏瑞 李瑞琴 倪永清

        摘要 [目的] 篩選并分析天山一號冰川冰層產(chǎn)淀粉酶的低溫酵母菌。[方法] 對天山一號冰川冰層含冰凍土產(chǎn)低溫淀粉酶的低溫酵母菌菌株進(jìn)行篩選、純化,并對其生理多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究。[結(jié)果]從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離出60株酵母菌,并從中篩選出6株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株,根據(jù)細(xì)胞菌落形態(tài)、菌體特征和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析,6株菌分別隸屬于紅酵母屬(Rhodotorula)、隱球菌屬(Cryptococcus)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces),最適生長溫度為20~24 ℃,為兼性耐冷細(xì)菌。[結(jié)論]研究可為了解冰川酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性以及低溫淀粉酶的生物技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞 天山冰川;酵母菌;低溫淀粉酶;系統(tǒng)發(fā)育

        中圖分類號 S181+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2014)31-11095-02

        Phylogenic Analysis of Coldadapted Yeasts Producing Amylase from Permafrost of the Glacier No. 1 in the Tianshan Mountains

        LIU Minrui, LI Ruiqin, NI Yongqing*

        (College of Food Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

        Abstract [Objective] To screen and analyze coldadapted yeasts producing amylase from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains. [Method] The screening and purification were conducted, physiological diversity and phylogenetic diversity were studied. [Result] The coldadapted amylaseproducing strains of yeasts was isolated from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains. Among 60 selected and purified strains of yeasts, only 6 isolates were coldadapted amylaseproducing strains by using the screening media containing starch. Based on their phenotypes and 26S rDNA gene D1/D2 sequences, 6 coldadapted amylaseproducing strains of yeasts belonged to 3 genera Rhodotorula, Cryptococcus and Sporobolomyces. Six isolates producing amylase showed the optimal growth temperature ranging from 20 ℃ to 24 ℃, indicating that they were psychrotrophic. [Conclusion] The results enrich our knowledge on the phylogenetic and physiological diversity of coldadapted strains of yeasts producing amylase in cold environments.

        Key words Tianshan Mountains; Yeast; Coldadapted amylase; Bacterial phylogeny

        地球生物圈3/4屬于永久低溫環(huán)境,包括南北兩極及環(huán)極地地區(qū)、深海海水、高原高山地區(qū)[1]。低溫環(huán)境中微生物分泌的胞外酶在中、低溫度下具有較高催化活性,在工農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值[2]。因此,低溫微生物及低溫酶的冷適應(yīng)機(jī)制研究成為當(dāng)前的一個熱點。淀粉酶是水解淀粉及糖原的酶類總稱[3],是重要的工業(yè)用酶,應(yīng)用于食品、洗滌、飼料、制藥、紡織和造紙等工業(yè)。低溫淀粉酶在生物工程領(lǐng)域及解決現(xiàn)代能源危機(jī)中有著廣泛的應(yīng)用前景。目前,國外主要針對南極冰川可培養(yǎng)的低溫酵母菌多樣性的研究較多[4],但對酵母菌產(chǎn)酶性能的研究較少。我國關(guān)于低溫酵母菌及其產(chǎn)淀粉酶的研究報道大多來自海洋深水處[5],對其他冷生境中酵母菌的研究很少。筆者對天山一號冰川冰層含冰凍土產(chǎn)低溫淀粉酶的低溫酵母菌菌株進(jìn)行篩選、純化,并對其生理多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究,為低溫淀粉酶在工農(nóng)業(yè)及食品生物技術(shù)各領(lǐng)域的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 原料。凍土樣品于2012年9 月采自天山一號冰川西支的冰川尾部,海拔3 833 m(43°07.125N,86°48.707E)。

        1.1.2 主要試劑。PCR 擴(kuò)增所用全套試劑、引物均購自TaKaRa 公司,其余試驗所用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

        1.1.3 主要儀器。PCR 擴(kuò)增儀 Tpersonal,德國 Biometra;水平電泳儀 PowerPac Universal,德國 BioRad;凝膠成像系統(tǒng)Gel DocTM XR,德國 BioRad;紫外-可見光分光光度計Ultrospec 5300 pro,美國 GE Healthcare。

        1.1.4 培養(yǎng)基。

        分離培養(yǎng)基RB(Rose Bengal agar)+ tetracycline 培養(yǎng)基[6],瓊脂1.5%;液體富集培養(yǎng)基YEPG(酵母提取物10 g/L,peptone 10 g/L,葡萄糖20 g/L);基礎(chǔ)培養(yǎng)基YEPG(酵母提取物10 g/L,peptone 10 g/L,葡萄糖20 g/L),瓊脂粉1.5%;選擇培養(yǎng)基(酵母提取物10 g/L,peptone 10 g/L,可溶性淀粉2%),瓊脂粉1%;以上培養(yǎng)基pH均為6.8,121 ℃滅菌20 min。

        1.2 菌株的分離與純化

        富集培養(yǎng),10 ℃培養(yǎng)48 h,使菌種增殖。采用梯度稀釋平板涂布法于分離培養(yǎng)基上進(jìn)行分離。10 ℃培養(yǎng)7 d,轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3次后,根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)等表型差異進(jìn)行初步分離篩選并純化,所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPG 基礎(chǔ)斜面培養(yǎng)基上,編號,4 ℃保藏備用。

        1.3 產(chǎn)低溫淀粉酶菌株篩選

        在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的低溫菌株,24 ℃培養(yǎng)3 d后在培養(yǎng)基表面分別滴加稀碘液,觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。

        1.4 菌株最適生長溫度測定

        將6株產(chǎn)淀粉酶酵母菌株接入YEPD 液體富集培養(yǎng)基(pH為6.0)中,分別在16、20、24、28、37 ℃ 5個溫度下培養(yǎng),培養(yǎng)48 h 后600 nm 測OD值。

        1.5 26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析

        提取單菌落的DNA,采用酵母菌26S rDNA 基因通用引物NL1 和NL4擴(kuò)增26S rDNAD1/D2 區(qū)基因片段[7]。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,36次循環(huán)(94 ℃變性40 s,55 ℃復(fù)性40 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用EZ10 column PCR Product Purification kit純化后,由上海生工生物科技有限公司直接測序。所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列搜索,CLUSTAL X 1.83 軟件對齊序列,采用鄰接法neighborjoining和MEGA4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹,進(jìn)化樹分支的置信度采用bootstrap法,重復(fù)次數(shù)為1 000[8]

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酵母菌的分離純化及產(chǎn)酶菌株的篩選結(jié)果

        從天山一號冰川冰層含冰凍土中共分離純化到60株酵母菌菌株,從中篩選到6株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株,編號分別為C9、L1、L15、L18、L27、L34。

        2.2 菌種形態(tài)與菌體特征鑒定結(jié)果

        篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察其菌落形態(tài)和菌體特征,結(jié)果如表1。

        3 討論

        淀粉酶廣泛存在于動物、植物和微生物中[10],是一類非常重要的工業(yè)用酶,目前國內(nèi)外市場中常用的淀粉酶一般都是中溫或高溫淀粉酶,最適酶活溫度一般都在50 ℃左右,在0~20 ℃低溫范圍活力很低[11],不適于食品、飼料、紡織和洗滌劑、制藥等低溫處理的條件而限制其應(yīng)用,但低溫淀粉酶的最適酶活溫度一般在40 ℃以下,因此其很好地解決了這一難題,具有中、高溫淀粉酶無法取代的優(yōu)越性。該試驗從天山一號冰川冰層含冰凍土中分離、純化出60株酵母菌菌株,篩選出6株產(chǎn)低溫淀粉酶的酵母菌菌株,并對所分離的菌株進(jìn)行較系統(tǒng)的分類鑒定,為低溫淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論和實踐基礎(chǔ),以解決酶來源的問題。到目前為止,盡管文獻(xiàn)報道低溫淀粉酶比中溫酶有許多的優(yōu)勢,但低溫酶生物技術(shù)的應(yīng)用開發(fā)并不成熟,針對于冷環(huán)境中微生物資源的開發(fā),還需在培養(yǎng)方法和技術(shù)上取得突破[2]。

        參考文獻(xiàn)

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        [3] 胡學(xué)智.國內(nèi)外酶制劑工業(yè)及其應(yīng)用[J].工業(yè)微生物,2001,31(3):41-46.

        [4] 李田,劉光繡,安黎哲.低溫微生物的適冷特性研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].冰川凍土,2006,28(3):450-455.

        [5] 王曉紅,池振明.產(chǎn)淀粉酶海洋酵母菌的研究及鑒定[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2007,37(2):5-6.

        [6] TURCHETTI B,BUZZINI P,GORETTI M,et al.Psychrophilic yeasts in glacial environments of Alpine glaciers [J].FEMS Microbiol Ecol,2008,63:73-83.

        [7] SUEL B,BORK P,HUYNEN M.Genome evolution:gene fusion versusgene fission [J].Trends Genet,2000,16(1):9-11.

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        [9] MORITA R Y.Psychrophilic bacteria[J].Bacteriol Rev,1975,39:146-166.

        [10] 錢海豐,趙曉娟,趙心愛.a淀粉酶基因表達(dá)的調(diào)控[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2003,12(4):87-90.

        [11] MARGESIN R,SCHINNER F.Biodegradat ion of organic pollutant s at low temperatures[M]//Biot echnological Applications of Coldadapted Organisms,Berlin;New York:Springer,1999:271-289.

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