邱驊婧，劉占舉

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200072)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其主要臨床表現(xiàn)為黏液膿血便、腹痛、大便次數(shù)增多和體質(zhì)量的下降等［1］。IBD的發(fā)病機制目前尚不明確，誘發(fā)IBD的四大要素為基因異常、免疫調(diào)節(jié)紊亂、腸屏障功能受損和腸道菌群改變［2］。研究表明，多種細菌在該疾病發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用，如難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile，Cd)、沙門氏菌(salmonella，Sm)和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，Sa)［3-5］，能通過黏附于腸黏膜上皮細胞對其進行破壞，并誘導(dǎo)疾病復(fù)發(fā)［6］。本研究通過觀察上述3種細菌在IBD患者和健康者中的表達差異，分析腸道細菌感染與炎癥性腸病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6月至2013年11月在同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科確診的IBD患者180例及80例健康者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國炎癥性腸病診療共識意見［7］。病例排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病程短于3個月;(2)4周內(nèi)使用頭孢類、甲硝唑、青霉素和萬古霉素抗生素;(3)正進行灌腸及腸道準(zhǔn)備者。詳細記錄每位IBD患者的年齡、性別、疾病分型、內(nèi)鏡檢查、治療方法和吸煙史等臨床資料。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

抽取空腹患者和健康者的靜脈血液2 ml，簡單離心后收集血清并立即儲存于80℃冰箱中直至使用。血清樣本進行Cd、Sm、Sa的雙抗體夾心ELISA檢測(購自美國RD公司)，每塊96孔板上設(shè)置陰性對照2孔，陽性對照2孔，空白對照1孔，樣品采用復(fù)孔檢測，最后使用BioTek Synergy2儀器于450 nm波長處讀取空白孔調(diào)零后的各孔吸光度值(D450)。試驗有效性判定:陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照孔≤0.10。臨界值陰性對照孔0.15，樣品D450≥臨界值為細菌感染陽性。

1.3 PCR 試驗

使用無菌EP管收集患者和健康者清晨第1次排便時的糞便約1 g(或1 ml)，30 min內(nèi)儲存于80℃冰箱中，并于24 h內(nèi)使用糞便DNA提取試劑盒進行提取(購自中國天根公司)，DNA的D260/D280比值均在1.7～1.9范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)菌株購自國家菌種保藏中心，細菌引物由上海生工公司合成，使用TaKaRa公司SYBR Premix EX Taq試劑盒對DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA進行擴增檢測。

難辨梭狀芽孢桿菌毒素A(158 bp)上游引物:5'-TCTACCACTGAAGCATTAC-3';下游引物:5'-TAGGTAC-TGTAGGTTTATTG-3'。沙門氏菌stn基因(260 bp)上游引物:5'-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3';下游引物:5'-TGCCCAAAGCAGAGAGATTCTG-3'。金黃色葡萄球菌femB基因(93 bp)上游引物:5'-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA-3';下游引物:5'-TGCGCAACACCCTGAACTT-3'。

1.4 病例分組

本實驗包括100例CD和80例UC，其中52例活動期 CD(A-CD)、48例緩解期 CD(R-CD)、41例活動期 UC(A-UC)、39例緩解期 UC(RUC)，通過克羅恩病疾病活動指數(shù)(Crohn's disease activity index，CDAI)、克羅恩病內(nèi)鏡下評分(the simple endoscopic score for Crohn's disease，SESCD)和Mayo指數(shù)分別對CD和UC的病情嚴(yán)重程度進行評分，活動期CD患者CDAI評分超過150，活動期 UC患者 Mayo指數(shù)超過3［8］。ELISA和PCR方法同時能夠檢測出時，可判定存在細菌感染。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。應(yīng)用ANOVA分析各組間D值差異，χ2檢驗用來評價細菌感染陽性和陰性兩組間各項指標(biāo)是否存在差異，數(shù)值以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況分析

在參與此次研究的180例IBD患者中，平均年齡(38.85 ±17.06)歲，男女比例 1.2∶1，平均病程(4.58±2.15)年。在 80例健康者中，平均年齡(28.52 ±9.08)歲，男女比例 1∶1。

2.2 各組難辨梭狀芽孢桿菌感染情況分析

IBD患者Cd感染率為10.6%(19/180)，顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，其中活動期CD患者Cd感染率17.3%(9/52)，活動期UC患者Cd感染率21.9%(9/41)，見表1。處于活動期CD或UC患者Cd感染率顯著高于緩解期患者(P=0.008，0.022)，而CD 組與UC 組Cd 感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.448)。使用ANOVA分析可見，活動期CD患者OD值顯著高于緩解期CD患者(P=0.024)，而活動期UC患者OD值與緩解期UC患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062)。

表1 各組難辨梭狀芽孢桿菌感染情況比較Tab.1 Comparison of the intestinal infection of Clostridium difficile in different groups

2.3 各組沙門氏菌感染情況分析

IBD患者沙門菌感染率為8.3%(15/180)，顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)，其中活動期CD患者感染率為13.5%(7/52)，活動期UC患者感染率為19.5%(8/41)，見表2，處于活動期CD或UC患者沙門菌感染率顯著高于緩解期患者(P=0.025，0.011)，而 CD 組與 UC 組感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.469)。使用ANOVA分析可見，活動期CD和UC患者D450值均顯著高于緩解期患者(P=0.015，0.01)。

表2 各組沙門氏菌感染情況比較Tab.2 Comparison of the intestinal infection of Salmonella in different groups

2.4 各組金黃色葡萄球菌感染情況分析

IBD患者金黃色葡萄球菌感染率為7.8%(14/180)，顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)，其中活動期CD患者感染率為13.5%(7/52)，活動期UC患者感染率為17.1%(7/41)，見表3，處于活動期CD或UC患者金葡菌感染率顯著高于緩解期患者(P=0.025，0.021)，而CD組與UC組的感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.663)。使用ANOVA分析可見，活動期CD和UC患者OD值均顯著高于緩解期患者(P=0.000，0.005)。

表3 各組金黃色葡萄球菌感染情況比較Tab.3 Comparison of the intestinal infection of Staphylococcus aureus in different groups

2.5 臨床特征與細菌感染關(guān)系

在發(fā)生Cd、Sm和Sa感染的各19、15和14例IBD 患者中，分別有 84.2%(16/19)、86.7%(13/15)和85.7%(12/14)的患者的病變部位包含結(jié)腸，有 84.2%(16/19)、80.0%(12/15)和 92.9%(13/14)的患者使用激素治療，有 78.9%(15/19)、93.3%(14/15)和92.9%(13/14)的患者使用美沙拉嗪治療，有 100%(19/19)、86.7%(13/15)和92.9%(13/14)的患者使用免疫抑制劑治療，有31.6%(6/19)、40.0%(6/15)和 42.9%(6/14)的患者有吸煙史。而在相應(yīng)未發(fā)生Cd、Sm和Sa感染的 IBD 患者中，分別有 57.1%(92/161)、55.8%(92/165)和54.2%(90/166)的患者的病變部位包含結(jié)腸，有 37.3%(60/161)、36.4%(60/165)和37.3%(62/166)的患者使用激素治療，有 80.7%(130/161)、90.9%(150/165)和 87.3%(145/166)的患者使用美沙拉嗪治療，有18.6%(30/161)、24.2%(40/165)和 18.1%(30/166)的患者使用免疫抑制劑治療，有 24.8%(40/161)、33.3%(55/165)和30.1%(50/166)的患者有吸煙史。分析可得，病變部位包含結(jié)腸或使用激素及免疫制劑治療的IBD患者的Cd、Sm和Sa的感染率明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而IBD患者的吸煙史及美沙拉嗪治療與上述3種細菌的感染無顯著關(guān)聯(lián)(P ＞0.05)。

3 討 論

正常人腸道大約有上億個細菌，重量約1 kg，相當(dāng)于一個正常成人的肝臟。腸道共生菌在人體免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)吸收和解除毒素方面發(fā)揮著重要作用［9］。高糖、高脂肪、高蛋白質(zhì)及低纖維飲食會逐漸破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài)［10］。腸道細菌穩(wěn)態(tài)的失衡不僅能夠誘發(fā)腸道發(fā)生炎癥損傷，而且腸道菌群與腸道黏膜之間反應(yīng)通路異常會導(dǎo)致腸道腫瘤發(fā)生［11］。隨著飲食及生活習(xí)慣與西方國家逐漸相近，近年來IBD在我國的發(fā)生率逐年升高，雖然腸道細菌組成的多樣性已被報道［12］，但有關(guān)我國IBD患者腸道細菌感染的研究仍較少。梭狀芽孢桿菌是一種陽性厭氧致病菌，其感染率在IBD患者中高，不利于疾病的緩解與愈合［13］。沙門菌通過轉(zhuǎn)運腸濾泡上皮細胞進入扁平細胞，使腸道黏膜抵抗侵襲能力下降［14］。金黃色葡萄球菌是一種機會致病菌，能夠黏附于人體腸道黏膜，但某些乳酸細菌通過抗黏附和抗微生物作用對其進行替代［15］。HLA B27轉(zhuǎn)基因小鼠在無菌環(huán)境中不發(fā)生結(jié)腸炎，而灌腸注入普通擬桿菌等侵襲性細菌后，小鼠發(fā)生輕度至中度的結(jié)腸炎［16］。迄今為止，只有10% ～40%的細菌能夠進行人工培養(yǎng)基培育，提高了鑒定腸道菌群種類的難度。

本研究結(jié)果顯示，IBD患者腸道細菌感染率高于健康者，活動期患者高于緩解期患者。三種細菌中Cd感染率最高為10.6%，1例UC患者同時感染三種細菌，1例CD患者和1例UC患者同時感染沙門菌與金葡菌，2例UC患者同時感染Cd與沙門菌。病變部位包含結(jié)腸或使用激素及免疫制劑治療的IBD患者的感染率明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而IBD患者的吸煙史及美沙拉嗪治療與上述3種細菌的感染無顯著關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。雖然細菌感染率在IBD患者中較低，但細菌及毒性產(chǎn)物對疾病的發(fā)生和發(fā)展起著關(guān)鍵作用，檢測腸道細菌感染能幫助臨床醫(yī)師更好地評估患者病情。

由于本次研究中樣本量較少，只針對3種細菌進行檢測，無法排除其他細菌在炎癥性腸病中的重要作用。IBD中腸道菌群的多樣性尚需大樣本研究，細菌感染機制及合并細菌感染的IBD患者的相關(guān)臨床治療需要深入探討。

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