任 歆 黃 蕊 成學恭 李光來

煤炭總醫(yī)院神經(jīng)內科，北京 100028

腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病，包括腦出血及腦梗死，是致殘率及致死率非常高的疾病，每年可造成數(shù)十億的人群死亡或喪失勞動能力，給社會帶來嚴重的經(jīng)濟負擔和社會負擔。根據(jù)病變血管的不同，可以導致局灶性或彌漫性腦功能缺失，在臨床上可以導致患者肢體癱瘓、感覺缺失、言語功能障礙等，給患者的日常生活造成巨大困擾，缺血性腦卒中約占腦卒中的80%，包括腦栓塞、腦血栓形成及腔隙性腦梗死等。早期進行溶栓治療可以盡可能地恢復阻塞血管的血流，恢復梗死區(qū)的血供，以期恢復或改善梗死區(qū)的腦功能，但伴隨出現(xiàn)卻是明顯的再灌注損傷問題，后者不僅沒有恢復腦卒中造成的神經(jīng)功能缺失，反而導致病灶局部出現(xiàn)一系列繼發(fā)性改變，導致腦水腫及神經(jīng)功能損傷加重[1-2]。大量研究證實，再灌注損傷的機制包括：阻塞血管無復通、微循環(huán)障礙、能量匱乏、自由基大量生成、鈣超載及誘發(fā)一系列有害基因表達等。研究表明，腦缺血急性期可以導致機體應激性血糖升高，血糖水平的異常可以加重腦組織損傷。本實驗通過觀察不同血糖水平下，缺血再灌注損傷后腦細胞結構、ATP酶的活力及細胞氧化還原能力的變化，對動物模型溶栓過程中血糖水平進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作及分組

取24只健康雄性Wistar大鼠 （2～3月齡，230～260 g），采用急性腦缺血再灌注模型[4-5]，按照360 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，動物取仰臥位，雙側逐層分離出頸總動脈，以小動脈夾夾閉造成腦缺血，30 min以后松開動脈夾再灌注2 h，取靜脈血并斷頭處死，1 min內分離出額、顳、頂部大腦皮質，左側用做病理及電鏡檢查，右側置-70℃冰箱保存待測。

1.2 儀器與設備

普通胰島素與中性魚精蛋白鋅胰島素（中國徐州萬邦生化制藥有限公司，江蘇）、四乙氧基丙烷（TEP）、硫代巴比妥酸（TBA）等為國產分析純，黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤（美國Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）標準品（德國BOEHRINGER MANNHEIM公司），ATP測試盒與SOD測試盒（南京建成生物制品研究所），722光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠），透射電鏡（JEOL-100 型），光鏡（OLYMPUS-VANOX 型）。

1.3 分組及給藥

實驗分組：隨機分成4組，每組6只，分別為假手術組（A組），分離出雙側頸總動脈并備線即結束，作為對照；生理鹽水對照組（B組）；胰島素（2.1 U/kg）組（C 組）；胰島素（2.1 U/kg）+50%葡萄糖（2 g/kg）組（D組）。參考相關文獻資料[3，6]，在夾閉雙側頸總動脈造成腦缺血后，B組給予生理鹽水4 mL/kg經(jīng)腹腔內注射；C組給予胰島素2.1 U/kg（普通胰島素RI與中性魚精蛋白鋅胰島素NPH以1∶2的比例分別進行腹腔內注射和皮下注射）；D組給予給予胰島素2.1 U/kg（同C組），同時給予50%葡萄糖注射液2 g/kg腹腔注射。各組于術前0.5 h、術后0.5、1.5、2.5 h取尾血用微量血糖儀（ADVANTAGE，U.S.A）檢測血糖。對試驗動物以100 W照明燈照射，以保持動物肛溫在36.5～37.5℃之間。

1.4 實驗方法

1.4.1 腦組織丙二醛（MDA）測定 采用改良八木國夫法[7]。將腦組織制成1%勻漿，取0.3 mL于10 mL小試管中，加入0.7 mL蒸餾水，于漩渦器上混合30 s，加入0.5 mL TBA溶液，用玻璃棒攪拌使液體均勻，放入95℃左右的甘油浴中攪拌，加熱60 min后取出，放冷水中冷卻，加入2.5 mL正丁醇于漩渦器上提取30 s，再以3000 r/min離心10 min。吸取上清液于1 cm比色皿中，在分光光度計上于535 cm波長處，測定吸光度值。以正丁醇為參比。同時以四乙氧基丙烷標準溶液（1 nmol/mL）1 mL于10 mL小試管中，加入0.5 mL TBA溶液做標準，操作同上。

1.4.2 腦組織SOD測定 采用黃嘌呤氧化酶法。根據(jù)試劑盒提供的步驟進行，取腦組織上清液在分光光度計波長550 nm處比色，讀取OD值。按照每毫克腦組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個亞硝酸鹽單位（NU）。

1.4.3 腦組織ATP酶活性檢測 在體內ATP酶可以將ATP分解生成ADP和無機磷，因此無機磷的含量可間接反映ATP酶活力的狀態(tài)。根據(jù)試劑盒提供的步驟進行，在分光光度計波長660 nm處比色，讀取OD值。以每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位，即微克分子磷/（mg prot·h）。

1.5 腦組織形態(tài)學特點

試驗動物處死后在1 min內快速取出一側大腦半球，固定于中性福爾馬林液中，常規(guī)脫水、包埋后，切成0.3 mm的組織切片，以伊紅、蘇木精染色，置于OLYMPUS-VANOX型光鏡下，觀察腦組織形態(tài)結構。

每組試驗動物中隨機抽取2只，處死后快速取額、頂葉大腦組織，投入2.5%的戊二醛溶液中固定，30 min后取出，快速切割為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，重新投入固定液，按電鏡標本常規(guī)脫水、包埋后做超薄切片，切片在JEOL-100型透射電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組動物血糖水平比較

按照上述試驗方法，A組為假手術組，血糖水平在正常范圍內，B組血糖水平由于機體應激明顯升高，缺血再灌注1.5 h后升高更為明顯（P＜0.01），給予胰島素干預后 （C組）血糖水平明顯降低 （P＜0.01），與C組等量的胰島素干預并同時給予適當葡萄糖補充（D組），可將血糖水平控制在正常范圍的高限。見表1。

2.2 各組動物缺血再灌注后氧化應激反應指標的比較

大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內MDA、SOD含量變化研究結果表明，缺血再灌注損傷發(fā)生后，每100毫克腦組織蛋白內的MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，在B組及C組更為明顯（P＜0.01），而且兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；采用與C組等量胰島素加葡萄糖干預（D組）將缺血再灌注后血糖水平調節(jié)至正常值高限，其MDA含量及SOD含量同B組及C組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示血糖值在正常范圍高限可以減輕氧化應激損傷。見表2。

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與A組相比，#P＜0.01

組別 只數(shù) 缺血前0.5 h 缺血后0.5 h 缺血后1.5 h 缺血后2.5 h A組B組C組D組6 6 6 6 3.94±0.38 3.87±0.64 3.90±0.52 3.85±0.34 6.26±0.51 4.79±0.02 3.33±0.21#4.83±0.35 6.67±0.30 8.05±0.31#3.13±0.22#5.16±0.33 6.58±0.30 10.07±0.25#3.11±0.24#6.98±0.21

表2 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內MDA、SOD含量（±s）

表2 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內MDA、SOD含量（±s）

注：與 A組比較，#P＜0.01；與 D組比較，*P＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

組別 只數(shù) MDA（μmol/100 mg prot） SOD（NU/100 mg prot）A組B組C組D組6 6 6 6 40.42±4.91 59.33±5.59#*52.38±6.69#*44.13±4.27 188.67±20.93 126.12±20.43#*141.53±16.97#*170.80±14.23

2.3 各組動物缺血再灌注后腦組織內ATP酶活性的比較

在急性缺血再灌注損傷發(fā)生后，應激性血糖升高（B組）以及胰島素干預使血糖過度降低（C組）都可以導致腦組織內氧化應激加重，導致ATP酶活性的下降（P＜0.01），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而將血糖控制在正常值高限（D組）可以明顯升高ATP酶的活性，減輕氧化應激損傷（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內的ATP酶活性比較[微克分子磷/（mg prot·h），±s]

表3 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內的ATP酶活性比較[微克分子磷/（mg prot·h），±s]

注：與A組比較，#P＜0.01；與D組比較，*P＜0.01

組別 只數(shù) Na+-K+-ATPaseMg2+-ATPase Ca2+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase A組B組C組D組6 6 6 6 33.45±6.08 18.97±2.43#*21.75±2.90#*31.95±3.41 71.58±5.29 41.50±3.63#*44.02±6.57#*66.80±4.98 34.75±5.02 22.95±3.22#*25.87±4.24#*34.13±3.26 34.42±2.94 23.17±3.49#*24.30±4.85#*35.33±4.94

2.4 腦組織鏡下組織學改變

光學顯微鏡下腦組織切片：A組大腦皮質細胞分層清晰，細胞結構正常；腦缺血30 min，再灌注2 h后，B組與C組皮質細胞層次結構消失，排列紊亂，細胞水腫，胞核皺縮、深染，大部分錐體細胞突起消失，血管周圍水腫明顯；D組可見大腦皮質細胞仍有分層痕跡，少部分錐體細胞發(fā)生輕微腫脹，細胞突起有部分斷裂，但細胞內胞核大部分完整。

電鏡下超微病理改變：A組皮質細胞結構正常，核膜完整，細胞器及細胞核結構正常；缺血再灌注后，B組與C組皮質細胞呈均質化，核膜呈節(jié)段性破壞，核周水腫，線粒體嵴斷裂、脫失，基質顆粒脫落、消失，線粒體腫脹，呈燒瓶樣或空泡化，數(shù)量明顯減少，內質網(wǎng)腫脹，核糖體脫落，細胞膜呈節(jié)段斷裂，細胞突起消失；D組缺血再灌注損傷后病理改變明顯減輕，可見腦細胞水腫及血管周圍間隙內水腫較輕，皮層細胞層次基本存在，腦細胞內僅有部分線粒體發(fā)生腫脹，細胞器膜及核膜損傷較輕。

3 討論

已有組織形態(tài)學研究表明[8]，腦缺血再灌注后可以發(fā)生嚴重的組織損傷，主要表現(xiàn)為細胞及細胞器的膜損傷，細胞膜及線粒體膜崩解，核膜出現(xiàn)節(jié)段性損傷，內質網(wǎng)空泡化，核糖體脫落，細胞胞漿水腫疏松，細胞突起出現(xiàn)嚴重水腫甚至消失等。已有證據(jù)表明，腦缺血后再灌注可以導致氧自由基呈爆發(fā)性增加，并攻擊細胞膜及細胞器膜上的不飽和脂肪酸，從而破壞膜的完整性，導致膜功能損傷甚至喪失[9-10]。此外，缺血再灌注損傷還可以導致神經(jīng)元內DNA、RNA、蛋白質和氨基酸發(fā)生交聯(lián)氧化，多糖分子聚合和氧化，不能合成消除氧自由基以及修復細胞膜所需的蛋白酶，導致腦細胞功能的進一步惡化，從而使再灌注損傷進行性加重。本實驗研究表明，腦缺血30 min，再灌注2 h后，腦組織內MDA含量升高，SOD含量降低，ATP酶活力明顯降低，腦組織超微結構出現(xiàn)明顯病理改變，提示腦缺血再灌注后腦細胞出現(xiàn)嚴重的氧化應激損傷。

眾所周知，線粒體是自由基產生的重要場所。電子漏學說[11-12]解釋了氧自由基的生成途徑。線粒體通過呼吸鏈電子漏機制進入超氧自由基代謝途徑，生成有害的活性氧（ROS），包括O2-、H2O2等。 呼吸鏈底物端（泛醌區(qū)）及氧端（細胞色素區(qū)）均有電子漏出，底物端的電子漏導致線粒體生成O2-、H2O2，并還原成H2O，起到部分清除氧自由基的作用。多條代謝途徑的復雜平衡決定了線粒體生成氧自由基的水平。正常生理狀態(tài)下線粒體產生氧自由基的水平較低，而在腦缺血狀態(tài)下，由于細胞缺氧，線粒體內呼吸鏈處于高底物還原狀態(tài)，此時的細胞色素C大部分游離到胞漿中，有利于大量電子漏出及積聚。缺血后再灌注瞬間給處于高還原狀態(tài)的呼吸鏈迅速充氧，使細胞內氧自由基大量急劇生成[13]。在可承受的某一濃度范圍內，ROS可以誘導細胞進行脅迫應答，并通過改變許多基因表達來維持能量代謝以保護腦細胞；但當超過其可承受的臨界值后，ROS便可誘導線粒體膜滲透性發(fā)生改變，導致線粒體腫脹，線粒體功能下降，合成ATP減少，細胞膜上的各種ATP酶活性下降，導致細胞膜內外離子轉運失平衡，細胞外膜膜電位降低，作為細胞生死主開關的線粒體通透性轉變孔長時間開放，使得線粒體基質膨脹，線粒體外膜破裂，膜間隙中的細胞色素C、細胞凋亡誘導因子（AIF）、Ca2+以及膜間隙中其他凋亡因子被釋放至細胞質中。細胞色素C可以通過Apaf-1以級聯(lián)的方式激活各型胱冬肽酶，而細胞色素C的釋放與胱冬肽酶的激活之間又形成一個互相促進的反饋性自我放大回路，啟動凋亡程序[14]。線粒體間隙內的AIF是一種57 kD的雙功能黃素蛋白，除具有電子供體/受體功能以外，還可以獨立作用于核染色質，直接進入細胞核內，獨立地將DNA斷解為60 kb左右的片段，引起染色體凝縮和DNA的大規(guī)模斷片化，再灌注損傷可以導致AIF大量釋放[15]。同時，Ca2+的釋放也可以誘導死亡受體的配體表達，激活Ca2+依賴性酶、核酸酶、磷酸化酶，協(xié)助激活胱冬肽酶，激活的這些蛋白再以級聯(lián)反應作用于細胞內骨架蛋白、轉錄因子以及細胞周期調節(jié)蛋白，或直接作用于核DNA分子，引起細胞凋亡[16]。因此，減少氧自由基的生成，降低其對線粒體的損害，是減輕腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。

近年來，人們在對腦缺血急性期血糖水平的大量研究中發(fā)現(xiàn)，腦卒中急性期高血糖的發(fā)生率非常高，其形成原因可能是由于腦卒中引起的機體應激性高血糖：腦卒中導致患者下丘腦-垂體軸受到急性刺激，促腎上腺皮質激素分泌異常增多，增多的皮質醇可以導致蛋白分解加劇，糖異生原料增加，同時增加的皮質醇也會抑制葡萄糖的利用，從而間接促進了血糖升高。本實驗研究表明，高血糖可以導致機體氧自由基生成增多，ATP酶活性下降，ATP產生途徑破壞，鈉泵功能障礙，最終導致腦細胞水腫，同時糖原在體內無氧酵解也可加速產生乳酸，大量乳酸堆積也可以導致腦水腫加重和酸中毒，使腦梗死面積擴大，血腦屏障進一步破壞，增加腦出血轉化的風險[17-18]。高血糖還可增加血液中血小板的黏附力，減少前列環(huán)素的合成，使血液黏滯性增加，腦血管微循環(huán)障礙加重，從而導致卒中復發(fā)[19]。同時，人們在充分重視并積極治療高血糖時，臨床觀察發(fā)現(xiàn)低血糖同樣危害極大。因為腦細胞無能量貯備，因此對血糖的依賴極大，而腦卒中患者的腦細胞對低血糖的耐受更差，一旦出現(xiàn)低血糖，腦細胞的功能最先受損，并可能導致神經(jīng)功能的不可逆損害[20]。

本實驗從腦組織缺血再灌注后，大鼠體內不同血糖水平對腦細胞氧化還原狀態(tài)及能量代謝的角度，同時觀察腦組織超微病理結構的特點，進一步證實了：高血糖及低血糖水平，均可能導致氧化還原酶的破壞及ATP酶活力的下降，而正常高限的血糖水平下氧化還原損傷最小。提示高血糖及低血糖均可造成嚴重的缺血再灌注腦損傷。組織超微結構的表現(xiàn)也證明，將血糖水平控制在正常值高限可以明顯減輕缺血再灌注腦損傷。

在長期的動物實驗研究中[21]，局灶性腦缺血及不完全性腦缺血被認為更符合臨床缺血性中風，因而血糖水平對不完全性腦缺血再灌注損傷的影響為指導臨床研究及治療提供了新的實驗室依據(jù)。

[1]羅祖明，董佑忠，彭國光.腦血管疾病治療學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：455-462.

[2]HackeW，KasteM，OlsenTS，etal.Acutetreatmentofischemia stroke [J].Cerebrovascular Diseases，2000，10 （supple 3）：22-33.

[3]Voll CL，Aner RN.Insulin attenuates ischemic brain damage independent of its hypoglycemic effect[J].J Cereb Blood Flow Metab，1991，11（6）：1006-1014.

[4]Macmanus JP，Buchan AM，Hill IE，et al.Global ischemia can cause DNA fragmentation indicative of apoptosis in rat brain[J].Neurosci Lett，1993，164：89.

[5]開麗，王中峰.人參二醇組皂甙對缺血再灌注腦組織超微結構及NOS的影響[J].中國應用生理學雜志，1998，14（3）：205-207.

[6]王藝東，黃如訓，李玲，等.局灶腦缺血后胰島素對基因表達的影響[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2000，17（3）：144-146.

[7]齊風菊，周玫，陳瑗，等.血漿丙二醛含量測定方法-改良的八木國夫法[J].第一軍醫(yī)大學學報，1986，6（21）：152.

[8]Jekins LW，Povlishoke JT，Lewelt W，et al.The role of postischemia recirculation in the development of ischemia neuronal injury following complete cerebral [J].Neuropathol（Berl），1981，5：205-220.

[9]TraystmanRJ，KirschJR，KoehlerRC.Oxygenradicalmechanisms of brain injury following ischemia and reperfusion[J].J Appl Physiol，1991，71（4）：1185-1195.

[10]White BC，Rafols JA，De Graca DJ，et al.Fluorescent histochemical localization of lipid peroxidation during reperfusion[J].Ann Emerg Med，1992，21：634.

[11]趙衛(wèi)華，徐建興，陳清棠.缺血再灌注期間大鼠線粒體的變化[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2000，17（3）：133-135.

[12]Perez-Pinzon MA，Xu GP，Born J，et al.Cytochrome C is released from mitochondria into the cytosol after cere-bral anoxia or ischemia [J].J Cereb Blood Flow Metab，1999，19：39-43.

[13]Winker SP，Msnoz-Ruizl.Mechanism of action of mannitol[J].Surg Neurosurg，1995，45：59.

[14]Chen Q，Gong B，Almasan A.Distint stages of cytochrome release from mitochondria：Evidence for a feedback amplification loop linking caspase activation to mitochondrial dysfunction in genotoxic stress induced apoptosis[J].Cell Death Differ，2000，7（2）：227-233.

[15]Patterson SD，Spahr CS，Daugas E.Mass spectrometric identification of proteins released from mitochondria undergoing permeability transition [J].Cell Death Differ，2000，7（2）：137-144.

[16]Chakraborti T，Das S，Mondal M，et al.Oxidant，mitochondria and calcium：an overview[J].Cell Signal，1999，11（2）：77-85.

[17]趙大志.高血糖與急性腦卒中加重相關性分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24（20）：3095.

[18]余志平.高血糖與腦卒中的臨床和預后關系[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2008，5（16）：151-152.

[19]梁存福.急性腦梗塞患者早期空腹血糖水平與預后的關系[J].西南軍醫(yī)，2010，12（3）：417-418.

[20]Shintani S，Tsuruoka S，Shiigai.Hypoglycemia hemiplegia：a repeat SPECT study[J].J Neurol Neurolsury Psychiatry，1993，56：700-701.

[21]Auer RN.Insulin，blood glucose levels，and ischemic brain damage[J].Neurology，1998（supple 3）：39-43.