劉夢林 萬 軍 王夢龍 石 磊 馮 穎

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北武漢 430000

阿霉素是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物。自從1970年用于臨床治療腫瘤以來，被認(rèn)為是治療腫瘤的最有效的藥物之一。但是，1973年，Lefrak首次報(bào)道了阿霉素對全身各臟器及組織均有毒性作用，其中對心臟的毒性作用尤為明顯。因此，阿霉素在臨床上的應(yīng)用受到了限制[1]。一直以來，關(guān)于阿霉素心臟毒性的機(jī)制存在爭議，并未能得到一個完整的闡述。其中闡述得比較多的機(jī)制主要有：①阿霉素產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激[2]，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷甚至死亡。②阿霉素產(chǎn)生的氧自由基通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)打開Rya（ryanodine receptor）和損傷鈣離子清楚系統(tǒng)，釋放鈣離子，增加細(xì)胞內(nèi)的鈣水平[3-4]，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。③近來許多研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素引起心肌損傷與阿霉素促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬有關(guān)[5-6]。目前，許多研究利用阿霉素對心肌的毒性作用，將其用于制造擴(kuò)張型心肌病的模型。

ATP敏感鉀通道（KATP）是是電壓非依賴性的、配體門控通道，由Noma等[7]于1983年首先在豚鼠的心肌細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)。隨后多個研究發(fā)現(xiàn)，ATP敏感鉀通道還存在于人體多種器官及組織中，例如血管平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元、胰腺細(xì)胞等。研究表明，它是由四個內(nèi)向整流鉀通道（Kir6.x家族）亞單位和 4個調(diào)節(jié)性磺脲類受體（SUR）組成的八聚體[8]。Kir6.x家族已發(fā)現(xiàn)兩組成員：Kir6.1和 Kir6.2，SUR也發(fā)現(xiàn) 2種：SURl和 SUR2，SUR2又有 2種不同的剪接體形式即SUR2A和SUR2B。KATP通道的活性受ATP/ADP比例的調(diào)節(jié)，當(dāng)ATP/ADP比例下降時，KATP通道被激活。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)KATP通道的激活能對心臟產(chǎn)生保護(hù)作用，例如，KATP通道的激活是缺血預(yù)適應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。它的開放劑（尼可地爾、二氮嗪）目前已應(yīng)用于臨床治療高血壓、心絞痛等疾病[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)擬在前人的研究基礎(chǔ)上，用阿霉素制造心肌損傷模型，然后用尼可地爾進(jìn)行干預(yù)，探討尼可地爾對阿霉素?fù)p傷心肌是否能產(chǎn)生保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

45只6～7周健康雄性SD大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物使用許可證號：SCXK（京）2009-0004），體重 150～180 g。 隨機(jī)分為 3 組，每組各15只。三組大鼠的體重、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

尼可地爾（購置Sigma公司，貨號為N3539）；阿霉素（購置武漢大學(xué)人民醫(yī)院試劑科，產(chǎn)品批號為2QL 0051）；生理鹽水；超聲儀（美國 Acuson Sequoia型彩超儀，心臟探頭7V3，頻率為6.0 MHz）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 45只雄性SD大鼠用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組（每組各15只）。分別為對照組（A組）、阿霉素模型組（B組）、尼可地爾+阿霉素組（C組）。

1.3.2 造模 B、C組大鼠按2.5 mg/kg的量腹腔注射阿霉素，A組大鼠按2.5 mg/kg的量腹腔注射生理鹽水，1周1次，共持續(xù)6周。停藥后觀察2周，第8周開始C組大鼠按每次3 mg/kg的量用灌胃法灌入尼可地爾，1 次/d，持續(xù) 30 d。

1.3.3 超聲檢測 造模結(jié)束后，給各組大鼠稱重，并根據(jù)大鼠的體重按3.5 mg/100 g的劑量用1%的戊巴比妥鈉（雙蒸水稀釋）麻醉，然后用超聲儀器進(jìn)行心臟功能檢測，檢測的指標(biāo)包括舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、收縮末期容積（ESV）、舒張末期容積（EVD）及左室短軸收縮率（FS%）。

1.3.4 心肌形態(tài)學(xué)檢測 超聲測定完畢后，將大鼠按每3.5 mg/100 g的劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，打開胸腔，暴露心臟，游離大鼠的心臟，并將其放入10%KCl液中清洗掉血液，在干冰上切取其中部分心臟組織（橫向切）放入10%的福爾馬林中固定，然后石蠟包埋、切片、天狼星紅染色、顯微鏡下觀察并拍片，最后用IPP 6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算心肌組織的膠原分?jǐn)?shù)[11-12]。計(jì)算公式為：膠原容積分?jǐn)?shù)=膠原面積/（整個視野的總面積-空白面積）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較用方差分析，組間兩組比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

造模期間，A組大鼠全部存活，B組存活10只，C組存活11只。另B、C兩組均有部分大鼠出現(xiàn)活動減少、腹瀉、血性腹水、胸腔積液、體重增長速度減慢等情況。造模結(jié)束時，B組和C組大鼠平均體重小于A組（P＜0.01），而且 B組大鼠平均體重小于 C組（P＜0.05）。 見表1。

2.2 超聲結(jié)果

與A組比較，B組大鼠的心臟功能明顯受損，LVEDS、ESV 明顯增大（P ＜ 0.01），LVEF、FS%明顯降低（P＜0.01）；而與 B 組比較，C 組 LVEDS、ESV 明顯減小（P ＜ 0.01），LVEF、FS%明顯增高（P ＜ 0.01）。 見表1。

表1 超聲檢查結(jié)果及體重（±s）

表1 超聲檢查結(jié)果及體重（±s）

注：與 A 組比較，**P ＜ 0.01；與 B 組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；LVEDS：左室收縮末內(nèi)徑；ESV：收縮末期容積；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVEDD：左室舒張末內(nèi)徑；EVD：舒張末期容積；FS%：室短軸收縮率

組別 LVEDS（mm） ESV（mL） LVEF（%） FS% LVEDD（mm） EVD（mL） 體重（kg）A 組（n=15）0.17±0.050.02±0.0196.27±1.9169.71±4.810.55±0.070.40±0.13433.67±31.94 B 組（n=10）0.35±0.01**0.11±0.01**72.83±6.32**37.00±5.06**0.55±0.040.41±0.08319.50±49.99**C 組（n=11）0.24±0.02##0.04±0.01##86.65±4.88##50.92±6.19##0.49±0.550.29±0.09377.87±51.99**#

2.3 心肌形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

超聲檢測結(jié)束后，取部分心肌組織行天狼星紅染色，在光鏡下可見經(jīng)阿霉素處理后B、C組大鼠心肌組織均有不同程度纖維化，且均明顯高于A組，而給予尼可地爾灌胃后的C組大鼠心肌組織纖維化程度低于 B組（圖1，天狼星紅染色，400×）。 另外，B組心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)為 （3.79±0.98）%明顯比 A組[（1.58±0.41）%]高，兩者比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C組心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)為 （2.87±0.93）%，與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組心肌組織光鏡下圖片（天狼星紅染色，400×）

3 討論

尼可地爾屬硝酸酯類化合物，是由N-2（2-羥乙基）煙酰胺維生素和有機(jī)硝酸酯的部分結(jié)構(gòu)連接而成的化合物。它是一種ATP敏感性鉀通道開放劑，能舒張動脈血管，同時由于它的結(jié)構(gòu)中具有硝酸酯基，也能舒張靜脈血管。它兼有舒張兩種血管的作用，所以是用于治療心絞痛的新型藥物。更值得注意的是，越來越多的試驗(yàn)結(jié)果提示：鉀通道激活劑也通過增強(qiáng)能保護(hù)心臟不發(fā)生局部缺血的正常生理過程而發(fā)揮直接的細(xì)胞保護(hù)作用。主要機(jī)制可能為：①維持細(xì)胞的能量代謝：mitoKATP通道開放后，K+進(jìn)入線粒體，線粒體內(nèi)滲透壓升高，引起基質(zhì)腫脹，并激活電子傳遞鏈，促進(jìn)線粒體呼吸，使ATP生成增多，為細(xì)胞提高更多的能量[13]；另外，可通過保護(hù)的結(jié)構(gòu)和功能，使缺血缺氧期細(xì)胞內(nèi)高能磷酸化合物丟失減少。②減少Ca2+超載：KATP通道開放后，可減少Ca2+內(nèi)流，從而減輕線粒體內(nèi)Ca2+超載[14]。③減少細(xì)胞凋亡：KATP通道開放后，抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，從而抑制其下游凋亡蛋白的級聯(lián)反應(yīng)，起到抗細(xì)胞凋亡的作用。④抗自由基的生成：KATP通道開放逆轉(zhuǎn)鈣超載，穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)細(xì)胞膜的完整功能，減少氧自由基的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過采用阿霉素制造阿霉素?fù)p傷大鼠心肌的模型，模擬人類的擴(kuò)張型心肌病，然后用尼可地爾進(jìn)行干預(yù)，探討尼可地爾對阿霉素?fù)p傷大鼠心肌是否有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示阿霉素模型組大鼠的心臟功能明顯差于正常對照組，且心肌組織出現(xiàn)明顯的纖維化，說明阿霉素可致大鼠心臟功能下降和心肌纖維化。采用尼可地爾進(jìn)行干預(yù)后，大鼠心臟功能明顯改善，且心肌纖維化程度減輕，說明尼可地爾對阿霉素?fù)p傷心肌有保護(hù)作用，這跟眾多研究所證實(shí)的尼可地爾對缺血再灌注心臟有保護(hù)作用的結(jié)果一致。另外，尼可地爾干預(yù)組心肌纖維化程度比阿霉素組輕，而心肌纖維化是心肌氧化損傷或壞死、凋亡后的一種病理反應(yīng)，說明尼可地爾能抗氧化損傷及細(xì)胞凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致。但阿霉素模型組與尼可地爾干預(yù)組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)之間的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能的原因有：①本實(shí)驗(yàn)采用的樣本量不夠大，加上組內(nèi)課題差異較大，故有待增加樣本量行進(jìn)一步研究。②可能尼可地爾的劑量比較小，抗心肌纖維化的作用還不夠明顯。③心肌纖維化不單單是心肌氧化損傷或壞死、凋亡后的一種病理反應(yīng)，它還與其他多種因素有關(guān)，例如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）、免疫系統(tǒng)和多種細(xì)胞因子等[15]，可能尼可地爾與這些因素相互作用后，削弱了它抗心肌纖維化的作用。這些均有待行進(jìn)一步研究，以期望尼可地爾將來能用于臨床心肌病患者的治療中。

[1]Amie JD.The role of autophagy in doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Life Sciences，2013，93（24）：913-916.

[2]Zhang S，Liu X，Bawa-Khalfe T，et al.Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Nat Med，2012，18：1639-1642.

[3]Camello-Almaraz C，Gomez-Piilla PJ，Pozo MJ， et al.Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+signaling[J].Am J Physiol Cell Physiol，2006，291（5）：1082-1088.

[4]Kim SY，Kim SJ，Kim BJ，et al.Doxorubicin-induced reactive oxygen species Generation and intracellular Ca2+increase are reciprocally modulated in rat Cardiomyocytes[J].Exp Mol Med，2012，38（5）：535-545.

[5]Smuder AJ，Kavazis AN，Min K，et al.Doxorubicin-induced markers of myocardial autophagic signaling in sedentary and exercise trained animals [J].J Appl Physiol，2013，115（176）：85.

[6]Sishi BJ，Loos B，Van Rooyen J，et al.Autophagy upregulation promotes survival and attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Biochem Pharmacol，2013，85：124-134.

[7]Noma A，Shibasaki T.Membrane current through adenosinetriphosphate-regulated potassium channels in guinea-pig ventricular cells[J].J Physiol，1985，363：463-480.

[8]Eirini K，Li B，Michael JR，et al.KATP channels as molecular sensors of cellular metabolism [J].Nature，2013，440（7083）：470-476.

[9]徐林，張登文，張傳漢，等.心肌細(xì)胞膜ATP敏感性鉀離子通道——從基礎(chǔ)到臨床[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2013，10（5）：299-303.

[10]Hsi CY，F(xiàn)ang SY，Chen YZ，et al.Cardiovascular protection of activating KATP channel during ischemia-reperfusion acidosis[J].Shock，2012，37（6）：653-658.

[11]Ding WY，Liu L，Wang ZH，et al.FP-receptor gene silencing ameliorates myocardial fibrosis and protects from diabetic cardiomyopathy[J].Journal of Molecular Medicine，2012，（56）：596-607.

[12]Querejeta R，Varo N，Lopez B，et al.Serum carboxy-terminal propertide of procollagen typeⅠis a marker of myocardial fibrosis in hypertensive heart disease[J].Circulation，2000，101：1729-1735.

[13]Swyers T，Redford D，Larson DF.Volatile anesthetic-induced preconditioning[J].Perfusion，2014，29（1）：10-15.

[14]Calderone V，Testail L，Martelli A，et al.Anti-ischemie properties of a new spirocyclic benzopyran activator of the mito-KATP channel[J].Biochem Pharmacol，2010，79（1）：39-47.

[15]Kuwahara F，Kai H，Tokuda K，et al.Transforming growth factor-beta function Bloking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded rats[J].Circulation，2002，106：130-135.