張亞茹，何玉川，張 英

0 引言

土霉素片原標(biāo)準(zhǔn)WS1-C2-0002-89中的含量測(cè)定采用抗生素微生物檢定法的管碟法。因其方法操作繁瑣，影響因素諸多，檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，尤其不利于生產(chǎn)企業(yè)中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為了更有效地控制該藥品質(zhì)量，本文采用了高效液相色譜法測(cè)定土霉素片的含量，方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀日立L-2000;電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) TU-1901(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);酸度計(jì) FE20K(梅特勒托利多儀器有限公司);土霉素標(biāo)準(zhǔn)品874 U/mg(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0305-200720);土霉素片:吉林市鹿王制藥股份有限公司、赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司、天津天士力(遼寧)制藥有限公司。色譜純乙腈，自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:Diamonsil C18(2)5 μm 250×4.6 mm 色譜柱;柱溫:30℃;流動(dòng)相:0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19(用磷酸調(diào)pH為2.0);流速0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):353 nm;進(jìn)樣量:20.0 μL;土霉素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于2.0。

2.2 供試品溶液與對(duì)照品溶液的制備 取土霉素片10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，稱(chēng)取適量用鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解、過(guò)濾，制成20 μg/mL的溶液，作為供試品溶液。另精密稱(chēng)取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量同法制成20 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 空白干擾試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、稀釋劑各20.0 μL分別注入高效液相色譜儀，在供試品溶液的液相色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的色譜峰，而稀釋劑色譜圖中在此位置并無(wú)色譜峰，證明本方法可行，稀釋劑無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

3 結(jié)果

圖1 HPLC色譜圖

3.1 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量至50 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)溶解并稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.05 mg/mL。分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 1、2、3、4、5、6 mL至10 mL量瓶中，加鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，分別吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液20.0 μL注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積(753940、1494132、2276211、3073063、3816665、4612532)，以土霉素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X軸，液相峰的峰面積為Y軸繪制線性關(guān)系圖，并計(jì)算線性關(guān)系方程。回歸方程為 y=154 614x-34 651，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9，說(shuō)明土霉素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在 5～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)(10 h) 精密吸取供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品峰面積的RSD%為0.9%(n=5)，說(shuō)明樣品溶液在10 h內(nèi)的穩(wěn)定性良很好。

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20.0 μL，依法連續(xù)進(jìn)樣6次并測(cè)定。結(jié)果土霉素標(biāo)準(zhǔn)品主成分的色譜峰面積的RSD%為0.5%(n=6)，表明本方法的精密度很好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一供試品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份依法測(cè)定其含量，結(jié)果平均值為98.8%，RSD%為0.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量(含量98.8%，平均片重0.459 6 g)的供試品粉末9份，每份約7.5 mg，分成3組，每組3份，分別置9個(gè)100 mL的容量瓶中，第1組、第2組、第3組每瓶精密加入土霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(100 μg/mL)分別為5、10、15 mL，再加入鹽酸溶液(0.1 mol/L)稀釋至刻度，制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.6 樣品含量測(cè)定 按2.2方法操作，以外標(biāo)法計(jì)算土霉素的含量。結(jié)果3批樣品中130911、130315、20130501含土霉素分別為標(biāo)示量的98.8% ，97.4% ，96.5% 。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 現(xiàn)在用高效液相色譜法測(cè)定土霉素片含量的文獻(xiàn)很多，參考文獻(xiàn)中檢測(cè)波長(zhǎng)也各不相同，如有 267、268、254、280、353、355、350 nm等，比較混亂，本文選取在測(cè)定土霉素時(shí)的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)做了下述實(shí)驗(yàn)。

取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱(chēng)定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.02 mg的溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，結(jié)果在268.5 nm和353.1 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，但在268.5 nm左右處有稀釋劑雜質(zhì)峰的影響，而高效液相色譜法所用的也是紫外檢測(cè)器，故選取353 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 用于流動(dòng)相中試劑種類(lèi)的選擇及pH選擇文獻(xiàn)中用于高效液相色譜法測(cè)定土霉素的流動(dòng)相試劑種類(lèi)也很多，如草酸銨、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸氫二銨、磷酸二氫鈉、枸櫞酸等，本研究本著簡(jiǎn)單易得既保證檢驗(yàn)質(zhì)量，又降低實(shí)驗(yàn)成本的原則，選擇了本文中用于流動(dòng)相的試劑種類(lèi)。

對(duì)所用流動(dòng)相分別考察了pH4.8(未進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)時(shí))、pH 4.0、pH 3.0和 pH為2.0時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的分離度，只有pH為2.0時(shí)分離度達(dá)到要求，故選用0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈=81∶19(用磷酸調(diào)pH為2.0)為本方法的流動(dòng)相。

綜上所述，采用高效液相色譜法測(cè)定土霉素片中土霉素的含量具有簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，該法可用于土霉素片的質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010(二部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.

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