陳孔茂，唐小千，繩秀珍，邢 婧，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學水產動物病害與免疫實驗室，山東 青島266003）

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是脊椎動物B淋巴細胞在受到抗原刺激后活化、增殖、成熟后所分泌的效應性應答分子，在體液免疫防御中發(fā)揮重要作用。哺乳動物免疫球蛋白重鏈根據其恒定區(qū)氨基酸組成及抗原性差異，可分為γ，α，ε，μ和δ5種類型，分別相應構成IgG，IgA，IgE，IgM 和IgD［1］。相比于哺乳動物，魚類免疫球蛋白研究起步較晚，且在很長一段時間內人們認為魚類只存在IgM一種免疫球蛋白，隨著分子生物學研究的發(fā)展，近年在魚體上發(fā)現了IgD、IgT及IgNAR等免疫球蛋白類型［2－4］。其中，單體結構的IgD被視為最神秘的免疫球蛋白，它在機體內含量很低，抗體活性很難被檢測到，其基因與蛋白結構在不同物種之間變異較大，相比其他幾種免疫球蛋白而言，有關它的免疫學功能特性研究十分欠缺［5］。

魚類IgD重鏈編碼基因首次在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中被發(fā)現，其轉錄本為嵌合體結構，以IgM的μ1區(qū)作為第一個恒定區(qū)，在基因組上的位置緊接位于IgM下游，在部分B細胞中通過選擇性剪切與IgM發(fā)生共表達［6］。該發(fā)現打破了IgD僅存在于高等靈長類及嚙齒類動物中的認識束縛，預示著IgD在脊椎動物免疫系統(tǒng)進化中起著不可預知的重要作用，使得IgD相關研究得到了廣泛重視和關注［5］。近年來，多種重要經濟魚類的IgD重鏈基因被克隆鑒定，如鱖（Siniperca chuatsi）［7］、紅 鰭 東 方 鲀 （Takifugu rubripes）［8］、庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）［9］、大西洋鮭（Salmo salar）［10］、大西洋鱈（Gadus morhua）［11］等。通過對比研究發(fā)現，不同魚類IgD重鏈的恒定區(qū)數目和重復串聯方式存在較大的差異，從而使IgD分子量大小及抗原特性具有多樣化［12］。盡管目前IgD在除了鳥類以外的其它物種中都有報道，但對于IgD的免疫學功能特性研究仍很欠缺，最近研究顯示其可能在魚類系統(tǒng)免疫監(jiān)視以及免疫應答調節(jié)中起著重要作用，且其免疫應答表現出一定的組織特異性［13－14］。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我國重要的海水養(yǎng)殖經濟魚類［15］，開展其IgD的結構與免疫應答特性研究，有助于全面了解大菱鲆免疫系統(tǒng)防御特點，對魚類疾病免疫防治具有一定的理論和指導意義。本研究克隆并分析了大菱鲆mIgD重鏈基因，利用RT－PCR檢測其在各個組織器官中的表達情況，并通過實時熒光定量PCR檢測了大菱鲆在注射滅活細菌后IgD的應答表達。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大菱鲆購自青島市膠南某大菱鲆養(yǎng)殖場，體長為15～18cm，實驗前于連續(xù)充氣的大體積水槽中暫養(yǎng)1周。RRI、pMD－19T、Ex－Taq酶均購自 Takara公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit購于 Applied Biosystems公司；SMART cDNA Synthesis Kit購于 Clontech公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒購于TOYOBO公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒均購自北京百泰克公司；引物由上海生工公司合成。鰻弧菌（Vibrio anguillarum）及大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取健康大菱鲆的脾組織，按照Trizol（Invitrogen）說明書抽提總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測總RNA的完整度和純度，RNA濃度在吸光值260nm處定量后用于反轉錄合成cDNA的第一鏈。

1.3 大菱鲆IgD cDNA全長克隆

根據GenBank獲得已知魚類IgD的序列，設計簡并引物IgD Ft1和IgD Rt1（見表1）擴增IgD保守序列，根據獲得的IgD保守基因片段設計3′和5′RACE特異性引物（見表1），分別與SMART cDNA Synthesis Kit內的引物UPM聯合使用擴增大菱鲆IgD cDNA的3′和5′端序列。PCR反應條件為：94℃變性5min，1個循環(huán)；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)；4℃保存。PCR產物均用含0.5%EB的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，凝膠成像儀觀察結果。擴增的PCR產物使用北京百泰克公司生產的凝膠回收試劑盒純化后，克隆到pMD－19T載體，轉化到大腸桿菌DH5α菌株，PCR檢測陽性克隆后進行測序確認。

1.4 序列的生物信息學分析

利用 NCBI在線軟件 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）對大菱鲆IgD cDNA序列的開放閱讀框進行分析，并對由cDNA序列推導獲得的氨基酸序列進行蛋白質相對分子質量及理論等電點預測（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／），通過Smart在線軟件（http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）預測功能結構域。使用NCBI的BLAST程序（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）對大菱鲆IgD 重鏈恒定區(qū)δ1～δ7進行同源性比對分析，并選取不同魚類免疫球蛋白重鏈氨基酸序列，采用Clustal X 2.0軟件進行多序列比對分析，用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)生和進化分析，采用鄰位相連法（Neighbor－joining）構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 RT－PCR檢測IgD重鏈mRNA的組織分布

為了檢測IgD在不同組織和器官中的表達差異，隨機選取3條經暫養(yǎng)后的健康大菱鲆，取其外周血白細胞、鰓、肌肉、前腎、中腎、肝臟、腸、脾臟。利用Trizol法分別提取各組織總RNA。檢測確認RNA完整度及純度后，分別取1μg總RNA以 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit參照說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。分別以IgD F和IgD R作為IgD目的基因的擴增引物，以β－actin F和β－actin R作為內參基因的擴增引物，PCR反應體系為25μL。PCR反應條件為：94℃變性5min，1個循環(huán)；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸50s，33個循環(huán)（內參基因為30個循環(huán)）；72℃延伸10min，1個循環(huán)；4℃保存。PCR產物用含0.5%EB的1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 熒光定量PCR檢測IgD對滅活鰻弧菌免疫的應答表達

將暫養(yǎng)后的健康大菱鲆隨機分養(yǎng)于2個玻璃鋼水槽，每組25尾。以LB液體培養(yǎng)基增殖鰻弧菌，離心回收菌體后經0.5%的福爾馬林滅活，調整濃度至1×107cfu／mL。采用腹腔注射方式，實驗組每尾注射100μL鰻弧菌滅活菌液，對照組魚體注射等體積無菌PBS（0.01mol／L，pH＝7.4）。在注射前以及注射后4、8、12、24、48h分別隨機選取3尾大菱鲆，取前腎提取總RNA，檢測確認RNA完整度及純度后，分別取1μg總RNA 以 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一鏈。分別取1μL反轉錄產物作為模板，以qIgD F（δ7區(qū)）和qIgD R（TM 區(qū)）引物，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試 劑 盒 在Mastercycler ep Realplex（Eppendorf，Germany）PCR儀上進行熒光定量檢測，每個樣品設置3個重復。選擇β－actin作為內參基因，擴增引物分別為β－actin F和β－actin R（見表1）。擴增條件為：95℃30s，1個循環(huán)；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)；95℃15s，60℃30s，95℃15s，1個循環(huán)；4℃保存。按照2－ΔΔCt法計算魚體在免疫刺激后前腎組織中IgD基因相對表達量的變化情況，采用SPSS13.0進行數據統(tǒng)計分析，采用單因子方差（one－way ANOVA）分析不同時間點基因表達量的差異，以P＜0.05作為差異顯著的標準。

2 結果

2.1 大菱鲆IgD重鏈全長cDNA的克隆

以健康大菱鲆脾臟組織的總RNA為模板，利用簡并引物擴增得到1條240bp的目的片段，PCR產物經TA克隆后，測序及同源比對分析顯示其與魚類IgD具有較高的同源性。根據該序列設計特異性RACE擴增引物，分別經3′和5′RACE擴增獲得目的片段，經測序與序列拼接獲得大菱鲆IgD cDNA全長序列（Gen－Bank登陸號：JX235360）。該基因全長3 357bp，5′非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）為28bp，3′UTR為332bp，包含一個2 997bp的開放閱讀框，編碼999個氨基酸（見圖1）。

圖1 大菱鲆mIgD重鏈基因cDNA序列與推測的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of mIgD heavy chain in S.maximus

2.2 大菱鲆IgD重鏈編碼氨基酸序列分析

通過大菱鲆IgD重鏈氨基酸組成序列分析得知，其理論等電點為5.73，理論分子量為110kDa，在成熟肽中絲氨酸所占比例最高（11.5%），其次為蘇氨酸（8.2%）和亮氨酸（7.8%）。通過對其氨基酸編碼的結構域分析顯示，其由可變區(qū)和恒定區(qū)兩部分組成，可變區(qū)具有典型的 V－D－J基因結構，恒定區(qū)先后由μ1、δ1－δ2－δ3－δ4－δ5－δ6－δ7和跨膜區(qū)（Transmembrane，TM）組成，由此確定該基因為膜結合型免疫球蛋白D（Membrane－bounded Ig，mIgD）重鏈編碼基因（見圖1）。

利用大菱鲆mIgDδ1～δ7區(qū)氨基酸序列進行同源搜索，結果顯示其與庸鰈 （78%）、鱖 （71%）、牙鲆（Paralichthys olivaceu）（68%）、斜 帶 石 斑 魚 （Epinephelus coioides）（62%）、紅鰭東方鲀（58%）IgD 重鏈相應恒定區(qū)具有較高的同源性，并在此基礎上對各個δ區(qū)之間的相似度進行了比較（見表2）。將大菱鲆mIgD的δ1～δ7區(qū)域與以上幾種魚類IgD相應區(qū)域進行多序列比對，結果顯示大菱鲆mIgD每個δ恒定區(qū)內均具有高度保守的半胱氨酸與色氨酸位點（見圖2）。另外，利用鄰位相連法構建了包括大菱鲆mIgD在內的20不同硬骨魚類免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示IgM與IgD各自分別聚為一大支，IgZ與IgT聚為一大支，其中大菱鲆mIgD與庸鰈及牙鲆IgD聚為一小支（見圖3）。

表2 大菱鲆與其他魚類IgDδ恒定區(qū)氨基酸序列的相似性比較Table 2 Similarity comparisons of IgDδconstant regions between S.maximus and other fish species

2.3 IgD重鏈mRNA的組織分布

以β－actin基因作為內參，利用RT－PCR方法檢測了IgD重鏈編碼mRNA在大菱鲆不同組織內的表達豐度差異。結果顯示，其除了未在肌肉中檢測到之外，在外周血白細胞、脾臟、前腎、中腎、鰓、肝臟及腸道組織中均有不同程度的表達，其中在外周血白細胞、脾臟、前腎及中腎組織中表達量較高（見圖4）。

2.4 滅活鰻弧菌免疫大菱鲆后mIgD重鏈基因的應答表達

以β－actin基因作為內參，利用跨膜區(qū)特異性引物進行熒光定量PCR，檢測了大菱鲆在免疫滅活鰻弧菌后前腎組織內mIgD重鏈基因的相對表達量變化。結果顯示，在免疫鰻弧菌后mIgD重鏈基因呈現顯著表達下調，在免疫后8h時mIgD重鏈基因下調至最低水平（P＜0.05），相對表達量約為對照組的1／28，然后呈逐漸回復上調趨勢，在免疫后48h時免疫組mIgD相對表達量與對照組無顯著差異（P＞0.05）（見圖5）。

3 討論

不同魚類IgD的重鏈基因在結構上存在很大的差異，但是根據目前對魚類IgD重鏈基因結構研究發(fā)現，絕大多數魚體的IgD重鏈基因均包含VH、DJ區(qū)、μ1區(qū)和若干個δ恒定區(qū)，在此基礎上根據IgD存在形式的不同，在mIgD重鏈δ恒定區(qū)后接有TM區(qū)，而在sIgD重鏈δ恒定區(qū)后接有一小段分泌肽［12，16］。但是，最近也有研究發(fā)現在斑點叉尾鮰中存在VH區(qū)缺失型的sIgD分子，推測其可能行使著作為模式識別分子的一種較為原始的免疫功能，預示著IgD在特異性免疫和非特性免疫中均起著一定作用［16］。除了TM區(qū)和分泌肽的差異以外，魚類IgD重鏈的δ恒定區(qū)組成數目和重復串聯方式也存在很大的差異。例如，大西洋鮭、大西洋庸鰈、斑點叉尾鮰和草魚（Ctenopharyngodon idellus）的 mIgD 重 鏈 結 構 均 為 VDJ－μ1－δ1－（δ2－δ3－δ4）2－δ5－δ6－δ7－TM，其中δ2－δ3－δ4存在一次復制［6，9，17］；紅鰭東方鲀 mIgD 重 鏈結構 為 VDJ－μ1－（δ1－δ2－δ3－δ4－δ5－δ6）2－δ7－TM，其 中 δ1－δ2－δ3－δ4－δ5－δ6 存 在 一 次 復制［18］；虹鱒（Oncorhynchus mykiss）mIgD 重鏈結構為VDJ－μ1－δ1－δ2a－δ3a－δ4a－δ2b－δ7－TM，δ4后存在一次 δ2復制，且出現δ5－δ6的缺失現象［19］；而大西洋鱈 mIgD基因結構比較特殊，為 VDJ－μ1－δ1A－δ2A－δy－δ1B－δ2B－δ7－δM1－δM2，出現δy將δ1與δ2復制分開［11］。本文克隆獲得的大菱鲆mIgD重鏈基因結構與牙鲆、鱖的mIgD結構比較相似也相對簡單，不存在外顯子復制現 象，為 VDJ－μ1－δ1－δ2－δ3－δ4－δ5－δ6－δ7－TM［2，7］。通 過將大菱鲆mIgD與其它硬骨魚IgD重鏈恒定區(qū)氨基酸序列比對發(fā)現，恒定區(qū)中的每個δ區(qū)均存在多個色氨酸與半胱氨酸的保守位點，色氨酸對免疫球蛋白空間結構的形成及功能起著重要作用，而半胱氨酸形成二硫鍵，對形成與維持免疫球蛋白的空間結構起著決定性的作用［5］。

圖2 大菱鲆mIgD與其它硬骨魚IgD重鏈恒定區(qū)氨基酸序列的多序列比對Fig.2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of mIgD heavy chain delta domain in S.maximus with those of the other teleosts

魚類IgD的表達具有一定的組織特異性，但是不同魚體之間仍表現出一定差異性。牙鲆IgD主要在外周血中表達，其含量顯著高于前腎、中腎及脾臟組織，而在肝臟與心臟內未檢測到表達［2］；鱖IgD在外周血白細胞和前腎中的表達量較高，其次為胸腺、脾臟和中腎，而在心臟、腸、鰓、肝臟和腦中幾乎沒有檢測到表達［7］。本文結果顯示，大菱鲆IgD基因表達量在外周血白細胞中最高，其次是脾臟、前腎及中腎，且在鰓、腸道及肝臟組織內也有IgD表達。上述研究IgD組織分布的RT－PCR擴增目的片段均為IgD的δ恒定區(qū)，因此無法具體區(qū)分mIgD及sIgD的組織差異表達情況。然而，根據IgD跨膜區(qū)及分泌肽尾編碼序列設計特異性引物對虹鱒mIgD和sIgD分別進行的組織分布研究，顯示虹鱒mIgD和sIgD除了在脾臟、外周血及腎臟內具有較高的表達以外，在鰓組織內檢測到sIgD具有較高的表達量，推測魚類IgD在鰓組織免疫防御中起著重要作用［14］。本研究在大菱鲆鰓組織內檢測到較高的IgD表達量，但在大菱鲆體內是否存在sIgD仍需進一步研究。

圖3 硬骨魚類免疫球蛋白序列進化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 20 different immunoglobulins of teleost fish

圖4 大菱鲆IgD重鏈mRNA在各組織中分布情況Fig.4 Distribution of mRNA of IgD heavy chain in different tissues of S.maximus

圖5 大菱鲆在免疫滅活鰻弧菌后前腎組織中mIgD重鏈基因應答表達分析Fig.5 Time－course expression analysis of mIgD heavy chain in pronephros in response to the immunization with formalin inactivated V.anguillarum

目前，有關魚體IgD對免疫刺激的應答研究較少，僅在鱖中開展了免疫滅活柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）后的IgD應答研究，結果顯示鱖IgD重鏈基因在免疫后第3周在前腎和脾臟內表達量顯著上調，該表達調控類似于魚體分泌性IgM對抗原免疫刺激后的應答［20］。然而，在人體和小鼠研究中發(fā)現，mIgD與mIgM共表達于成熟的幼稚B細胞表面，當幼稚B細胞受到免疫原刺激，mIgD表達會發(fā)生快速下調［21－22］。最近研究也表明，IgD作為B細胞受體在B細胞發(fā)育、細胞間信號傳遞及刺激誘導其他免疫細胞分泌細胞因子中起著重要作用［23－24］。本研究發(fā)現，大菱鲆在免疫滅活鰻弧菌后，前腎組織中mIgD表達出現了快速顯著下調，在免疫后8h時表達量下降至最低水平，僅為對照組的1／28，然后逐漸恢復至正常水平。另外，通過對虹鱒魚B細胞表面mIgD豐度研究發(fā)現，在外周B淋巴細胞表面mIgD豐度存在高低差異分布［14］。因此，推測魚類IgD在免疫信號傳導及體液免疫防御中可能起著重要作用。

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