朱振興，楊瑞芳

(1.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450052;2.河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，鄭州 450000）

高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(high performance liquid chromatogrphy-mass spectrometry，LC-MS）將二者的優(yōu)勢進行了結(jié)合，即高效液相進行分離，質(zhì)譜進行檢測，即使復雜的混合物也能被HPLC分離，而質(zhì)譜則能提供高靈敏度的檢測，從而獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息。二者的聯(lián)用能夠發(fā)揮各自的最大優(yōu)勢和避免彼此的短處，從而獲得兩種儀器單獨使用時所不具備的功能［1］。中藥材指紋圖譜系指中藥材經(jīng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材特性的共有峰的圖譜［2］。指紋圖譜和中醫(yī)的思維方式相似即一種整體性和模糊性的思維方式，和傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量控制模式比較其更有優(yōu)勢，既強調(diào)不同種中藥的差異性又突出同種中藥的相似性。中藥指紋圖譜可以整體的、宏觀的和可以量化的信息［3］，中藥指紋圖譜的建立可以采用多種分析方法，而現(xiàn)代分析方法的發(fā)展剛好滿足了這一要求［4］。該文就LC-MS在中藥指紋圖譜研究的應用做一綜述。

1 LC-MS發(fā)展概況

LC-MS聯(lián)用技術在20世紀70年代開始研制，至今已有40多年的發(fā)展史，已經(jīng)發(fā)展為一種成熟、常規(guī)的分離分析方法，在醫(yī)藥、生物、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)境各個領域得到廣泛應用［1］。

LC-MS儀的分類:根據(jù)質(zhì)譜(mass spectrometry，MS）離子源(接口）和質(zhì)量分析器的不同可以將LCMS儀分為不同的類型。按離子源分類:熱噴霧離子源、大氣壓化學電離源、電噴霧離子源等。按質(zhì)量分析器分類:液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀，液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，以及液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，如三重四級桿質(zhì)譜儀，四級桿飛行時間質(zhì)譜儀等。

1.2 LC-MS聯(lián)用儀的組成 LC-MS聯(lián)用儀主要由高效液相色譜，接口裝置(同時也是電離源），質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。高效液相部分與一般的液相色譜相同。

LC-MS聯(lián)用的關鍵是二者之間的接口裝置，由于LC和MS工作狀態(tài)的差異較大，二者的匹配較氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）難度更大。接口裝置的主要作用是去除溶劑并使樣品離子化。LC-MS自從研制以來出現(xiàn)過多種接口裝置如傳送帶接口、熱噴霧接口、粒子束接口、快原子轟擊接口等［1］。20世紀80年代，大氣壓電離源用作LC-MS聯(lián)用儀的接口裝置和電離裝置后，使LC-MS聯(lián)用技術提高了一大步。目前，幾乎所有的LC-MS聯(lián)用儀都使用大氣壓電離源作為接口裝置和離子源。大氣壓電離源(atmospheric pressure ionization，API）包括電噴霧離子源(electrospray ior source，ESI）和大氣壓化學離子源(atmospheric pressure chemicl ionization，APCI）兩種，二者之中電噴霧源應用最廣。

1.3 常用離子源(接口）簡介 LC-MS聯(lián)用出現(xiàn)的各種接口裝置中以ESI應用最為廣泛，其工作原理(見圖1）為:溶劑由液相泵輸送到金屬毛細管噴嘴，毛細管加有2～4 kv的高壓，由于高壓和霧化氣的作用，流動相從毛細管頂端流出時，會形成扇狀噴霧。電噴霧離子化可分為3個過程:①形成帶電小液滴:由于毛細管被加高壓，發(fā)生氧化還原反應，形成帶電液滴。②溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂:溶劑蒸發(fā)，離子向液滴表面移動，液滴表面的離子密度越來越大，當達到Rayleigh(瑞利）極限時，即液滴表面電荷產(chǎn)生的庫侖排斥力于液滴表面的張力大致相等時，液滴會非均勻破裂，分裂成更小的液滴，在質(zhì)量和電荷重新分配后，更小的液滴進入穩(wěn)定態(tài)，然后再重復蒸發(fā)、電荷過剩和液滴分裂這一系列過程。③形成氣相離子:對于半徑＜10 nm的液滴，液滴表面形成的電場足夠強，電荷的排斥作用最終導致部分離子從液滴表面蒸發(fā)出來，而不是液滴的分裂，最終樣品以單電荷或多電荷離子的形式從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相，形成了氣相離子。在大氣壓條件下形成的離子在強電位差的驅(qū)動下，經(jīng)取樣孔進入質(zhì)譜真空區(qū)。

圖1 ESI電離源工作原理示意圖

離子源(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometev，LC-ESI-MS）譜圖主要給出準分子離子的相關信息以及大量的多電荷離子，而較少出現(xiàn)碎片離子。LC-ESI-MS常用于強極性、熱不穩(wěn)定化合物及高分子化合物的檢測。但ESI源對流量有一定的限制，即流量不能太大［1］。

APCI電離是在大氣壓條件下利用尖端高壓(電暈）放電促使溶劑和其他反應物電離、碰撞，及電荷轉(zhuǎn)移等方式，形成一個反應氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時，發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，形成了(M+H）+或(M-H）-離子或加和離子。一般ESI源加一個電暈放電針即APCI源。

APCI也是一種軟電離技術，與ESI相比適于極性較小的化合物。

2 LC-MS在中藥指紋圖譜研究的應用

中藥的現(xiàn)代研究雖然取得了很大的進展，但大多數(shù)中藥的有效成分依然沒有探明，作用機制更無從談起，顯然現(xiàn)行的靠單一指標評價中藥的質(zhì)量是片面的［5］。而高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用方式(HPLC-DAD-MS-MS）可以得到多維多息指紋圖譜。所謂多維，即采用多種分析儀器聯(lián)用模式。所謂多息，即特征譜應努力做到包括化學和藥效兩方面的信息。HPLC-DAD-MS-MS可以滿足這方面的需求，液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜可以提供中藥藥效和質(zhì)量關系的信息，且較其他的分析手段更加系統(tǒng)全面［4］。

王源園等［6］采用HPLC-UV-MS法對牛膝藥材的指紋圖譜進行研究，得到分離度、重現(xiàn)性均較好的牛膝藥材HPLC-UV指紋圖譜，并借助HPLC-MS技術對其主要色譜峰進行了初步歸屬，從而為牛膝的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。張尊建等［7］采用HPLC-UVMS法對忍冬和山銀花藥材進行指紋圖譜研究得到分離度和重復性均較好的忍冬和山銀花藥材HPLC-UV及HPLC-MS指紋圖譜，分別對忍冬指紋圖譜中8個色譜峰和山銀花圖譜中5個色譜峰進行了初步定性，并比較兩種藥材指紋圖譜的差異。余靜等［8］采用 HPLC-UV-MS法分別對刺五加藥材水溶性和脂溶性成分進行指紋圖譜研究，得到分離度和重現(xiàn)性均較好的刺五加藥材HPLC-UV及HPLCMS指紋圖譜，并分別對水溶性成分指紋圖譜中5個色譜峰和脂溶性成分指紋圖譜中8個色譜峰進行了初步定性，從而為刺五加藥材及其制劑的鑒別提供更加全面、可靠的依據(jù)。韓鳳梅等［9］采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜 (HPLC-ESI-MS）研究山麥冬甲醇提取物的指紋圖譜，其中山麥冬甲醇提取物色譜圖中有17個共有峰的重現(xiàn)性與精密度的RSD＜5%，HPLC-ESI-MS技術建立的山麥冬指紋圖譜特征性強、重現(xiàn)性較好，可用于山麥冬的品質(zhì)評價與品種鑒別。張尊建等［10］采用HPLC-UVMS對脈絡寧注射液(石斛、牛膝、玄參和金銀花）的指紋圖譜進行研究，以綠原酸為參照峰，標示出脈絡寧注射液10個共有峰，說明了其藥材歸屬，并采用HPLC-MS對主要色譜峰進行了初步定性，該方法準確、重現(xiàn)性好，為脈絡寧注射液的指紋圖譜質(zhì)量控制提供了依據(jù)。趙新峰等［11］建立了LC-ESI-MS定性分析六味地黃丸的方法，通過2級質(zhì)譜識別了其中的9種化學成分，結(jié)果表明，六味地黃丸的總離子流色譜圖比紫外色譜圖具有更強的特征性，以質(zhì)譜作為檢測器是一種很好的研究中藥指紋圖譜的方法。劉思明等［12］采用高效液相電噴霧離子阱質(zhì)譜對巖黃連注射液的指紋圖譜進行研究，對其中的11種主要成分進行了指認，LC-UV對其中的2種成分進行了定量評價，所建指紋圖譜能體現(xiàn)巖黃連注射液的特點，相似度評價和方法學考察結(jié)果良好，可用于巖黃連的質(zhì)量控制及定量測定。戴德舜等［13］采用HPLC-MS的方法對桂枝湯A部分的雙向調(diào)節(jié)樣品與單向升溫樣品進行了指紋圖譜研究，通過鎖定色譜峰中主要分子量的方法對照了桂枝湯A部分兩份不同藥效樣品，通過指紋圖譜與MS離子流圖相結(jié)合的方式分析了產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎，確認了樣品中所含物質(zhì)成分在量上的差異。晏媛等［14］采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術對蒲公英灌腸液色譜圖譜進行研究，通過質(zhì)譜的質(zhì)荷比M/Z及色譜保留時間的相互比較確定了咖啡酸、阿魏酸和原兒茶醛3種活性成分。王穎等［15］采用LC-MS技術測定了中藥三七(包括藥材、中間體及針劑成品）的指紋圖譜。對中間體和成品則直接進樣分析，并比較了三者的相關性。

綜上所述，LC-MS主要用于中藥的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎研究，無論在藥材還是制劑研究都得到了較廣的應用。它彌補了傳統(tǒng)方法定性鑒別、確定結(jié)構(gòu)能力有限的缺點，解決了傳統(tǒng)液相檢測器靈敏度和選擇性不夠的缺點，可以提供可靠、精確的相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，必將成為研究中藥復雜物質(zhì)體系的有力手段。

［1］李美發(fā).分析化學［M］.6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009.

［2］國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行）［S］.中成藥，2000，22(10）:671-675.

［3］王嗣雷，朱青芝.中藥指紋圖譜研究現(xiàn)狀及應用進展［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2006，24(15）:153-155.

［4］楊義芳，蔡定建.中藥指紋圖譜研究概況［J］.中草藥，2003，34(6）:99-102.

［5］邵清松，胡潤淮.HPLC-MS聯(lián)用技術在中藥指紋圖譜研究中的應用［J］.中國藥房，2007，18(12）:938-940.

［6］ 王源園，張尊建，王興旺，等.牛膝的HPLC-UV-MS指紋圖譜研究［J］.中藥材，2003，26(11）:787-789.

［7］張尊建，余 靜，楊春華，等.忍冬、山銀花 HPLC-UV-MS指紋圖譜研究［J］.中成藥，2003，25(11）:863-865.

［8］ 余 靜，李 茜，沈文斌，等.刺五加HPLC-UV-MS指紋圖譜研究［J］.中國藥科大學學報，2003，34(2）:148 ～150.

［9］韓鳳梅，李 紫，蔡 敏，等.山麥冬的 HPLC-ESI-MS特征指紋圖譜研究［J］.中草藥，2005，36(9）:1395-1397.

［10］張尊建，李 茜，余 靜，等.脈絡寧注射液HPLC-UV-MS指紋圖譜研究［J］.中成藥，2004，26(3）:175-178.

［11］趙新峰，孫毓慶.六味地黃丸的高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜分析［J］.色譜，2003，21(9）:500-502.

［12］劉思明，胡 坪，羅國安，等.巖黃連注射液的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜研究［J］.藥學學報，2005，40(9）:846～849.

［13］戴德舜，曹 進，王義明，等.桂枝湯A部分指紋圖譜的確定及比較(一）［J］.中國實驗方劑學雜志，2001，7(2）:1-4.

［14］晏 媛，劉世霆，許重遠.液質(zhì)聯(lián)用技術對復方蒲公英灌腸液的色譜指紋圖譜的分析［J］.第一軍醫(yī)大學學報，2005，25(4）:447-453.

［15］王 穎，陳新發(fā)，盛龍生.三七注射液指紋圖譜的LC-MS測定［J］.中藥新藥與臨床藥理，200112(3）:161-163.