仲崇艷

（滁州市水產(chǎn)研究所，安徽 滁州 239074）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)環(huán)境惡化和其它多種原因?qū)е录?xì)菌性疾病日益增多。由于養(yǎng)殖戶缺乏對(duì)魚病的正確認(rèn)識(shí)而濫用藥物，增加了細(xì)菌的耐藥性，使得抗菌藥對(duì)細(xì)菌性疾病的防治效果不理想，不但造成藥物浪費(fèi)，而且延誤病情。對(duì)疾病做出正確診斷，對(duì)癥下藥，對(duì)致病菌做藥敏試驗(yàn)是最科學(xué)的方法。按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，至少需1周～2周時(shí)間。對(duì)養(yǎng)殖戶來說，一旦魚發(fā)生病害，應(yīng)及時(shí)防治，減少損失。

測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)微生物有無(wú)抵制作用的方法稱為藥物敏感性試驗(yàn)，簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)。KB法，即通常所說的紙片擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)，是目前臨床上最常用的藥敏試驗(yàn)方法。其技術(shù)上簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好;試驗(yàn)成本相對(duì)較低，不需要特殊設(shè)備;抗菌藥物的選擇有很大的靈活性;藥敏結(jié)果解釋性分類（S、I、R）易理解［1］。經(jīng)典的藥敏試驗(yàn)選擇的是M-H培養(yǎng)基［1］，也有選擇肉膏-胰胨培養(yǎng)基［2］，而關(guān)于LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)鮮有報(bào)告。以鳊為例就LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)（K-B法）進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基［2］:蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化鈉0.5%，pH值7.2;121℃20min。LB固體培養(yǎng)基是在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%的瓊脂，121℃20min。

1.1.2 藥敏試紙

購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):WS/T125-1999）

1.1.3 0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度［1］

將0.5mL0.048moL/L的BaCl2（1.175%W/VBaCl2·2H2O）加入到 99.5mL0.18moL/L的H2SO4（1%W/V）中并不斷攪動(dòng)，以維持混懸狀態(tài)。

1.1.4 病魚

取自安徽滁州市某水庫(kù)急性發(fā)病的鳊（非缺氧、機(jī)械損傷，中毒與藥害導(dǎo)致的死亡）。

1.2 方法

1.2.1 LB藥敏平板的制作

將滅過菌的LB固體培養(yǎng)基放在無(wú)菌操作臺(tái)中，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到60℃左右時(shí)，倒平板（90mm培養(yǎng)皿，每皿注入培養(yǎng)基約20 mL）晾干備用。

1.2.2 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的制作［1］

0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟鄬?duì)的菌數(shù)為1.5×109CFU/mL，為標(biāo)準(zhǔn)參照物，直接購(gòu)買或配制（1%Bacl20.5 mL，1%H2SO49.5 mL）。

1.2.3 K-B紙片法的具體步驟

按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行［1］。

1.2.4 直接藥敏試驗(yàn)（又稱一步法藥敏試驗(yàn)）［4］

用70%的酒精棉球擦拭病魚體表，用消毒過的解剖剪，分別取肝臟和腎臟等組織勻漿液0.2mL涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥驗(yàn)試驗(yàn)。

1.2.5 富集培養(yǎng)藥敏法（增菌培養(yǎng)后再作藥敏）

將鳊病變的腎臟與肝臟組織勻漿液接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的試管或離心管中，36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～9h進(jìn)行增菌培養(yǎng)后做藥敏試驗(yàn)。

1.2.6 致病菌純培養(yǎng)后的藥敏試驗(yàn)

通過稀釋法，將純培養(yǎng)后致病菌液的濃度調(diào)整到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋?xì)菌濃度約為1.5×108/mL）;取0.2mL涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥敏試驗(yàn)。

1.2.7 抑菌試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)試驗(yàn)抑菌圈結(jié)果，并針對(duì)不同的抗生素、菌株參考NCCLS標(biāo)準(zhǔn)或CSLI標(biāo)準(zhǔn)，做出判斷。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 直接法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

見表1。

表1 直接法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 富集法培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

見表2。

表2 富集法培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

見表3。

表3 致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

3 討論

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過用直接法、富集法、致病菌純培養(yǎng)后3種方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):這3種方法試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著差異，在實(shí)踐中可根據(jù)需要靈活運(yùn)用。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《無(wú)公害食品漁藥藥物使用準(zhǔn)則》中規(guī)定環(huán)丙氟派酸等藥物屬于禁止用漁藥，可選擇其他幾種藥物使用。本試驗(yàn)選用了藥物中的諾氟沙星拌料投喂后兩天便控制了病情，效果顯著。

耐藥菌株的產(chǎn)生是魚病防治的一大難題，臨床準(zhǔn)確用藥，快速的藥敏報(bào)告是前提基礎(chǔ)。該技術(shù)簡(jiǎn)單易行，不需要特殊的儀器設(shè)備，重復(fù)性好［1］。對(duì)指導(dǎo)魚類病害防治，降低用藥成本，有重要作用，可積極推廣。

［1］倪語(yǔ)星，王金良，徐英春，等.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)規(guī)范［M］.上海科學(xué)技術(shù)出版社:17-26.

［2］周德慶，微生物實(shí)驗(yàn)教程（第2版）［M］:2006.3.

［3］廖詩(shī)英，張世卿.雞大腸桿菌TTC快速藥敏試驗(yàn)方法的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）;206.

［4］崔晨光，崔彥剛，邵素云.一步法藥敏試驗(yàn)在臨床診斷上的應(yīng)用［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2010（1）.

［5］李先斌，莫麗亞，趙蕊，等.用顯色半固體進(jìn)行快速細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的方法［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006.13.（2）;443-444.

［6］陳淑蘭，宋熙瑤，董娟，劉文博，趙金英.控制影響細(xì)菌藥敏試驗(yàn)（K-B法）質(zhì)量的各因素［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)報(bào)，1999年（2），157-158.