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        苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞生長的影響*

        2014-10-11 01:57:24雷佳紅郭曉蘭楊明輝川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕免疫研究所檢驗科四川南充67000川北醫(yī)學院檢驗系四川南充67007
        檢驗醫(yī)學與臨床 2014年18期
        關鍵詞:生長

        蔣 紅,雷佳紅,,何 城,郭曉蘭,2,,楊明輝,蔡 燕,2,△(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院:.風濕免疫研究所;2.檢驗科,四川南充 67000 ;.川北醫(yī)學院檢驗系,四川南充 67007)

        類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫疾病,主要臨床表現(xiàn)為慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變,常累及全身多個系統(tǒng),嚴重影響患者的生存質(zhì)量。RA在國內(nèi)發(fā)病率約為0.3%~0.4%,女性發(fā)病率高于男性[1]。目前臨床上多采用甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥物,阻斷淋巴細胞刺激因子的Kineret、腫瘤壞死因子阻斷劑英利昔單抗等生物制劑治療RA患者,雖然這些藥物療效明顯,但都有不良反應多或價格昂貴等缺點,增加了患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。研究顯示人成纖維樣滑膜細胞的過度增生和分泌在RA的發(fā)病和發(fā)展中具有重要作用[2]。本研究擬從中醫(yī)中藥的角度研究苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞生長的影響,探討苦參堿對RA的潛在治療作用。

        1 材料與方法

        1.1 人成纖維樣滑膜細胞 采集2013年1~8月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕科收治的7例RA患者關節(jié)積液標本,體外原代培養(yǎng)人成纖維樣滑膜細胞。7例患者中男2例、女5例;年齡36~60歲,平均50.4歲。

        1.2 儀器與試劑 生物安全柜(安泰公司);HF90CO2培養(yǎng)箱(力康公司);IX71倒置顯微鏡(日本OLYMPUS);酶標儀(美國Bio-RAD)。DMEM 培養(yǎng)基(美國 Gibco);胎牛血清(杭州四季青);四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(美國Sigma);胰蛋白酶(美國 Amresco);苦參堿(每瓶100mg,購自南京替斯艾么中藥研究所,純度大于98.0%),配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的藥物備用。

        1.3 方法

        1.3.1 人成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng) 無菌采集患者關節(jié)腔積10~30mL,1 000 r/min離心10min,棄上清后用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀,經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾,將濾液以1 000 r/min離心10min,再以PBS清洗沉淀2次后,以含10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100U的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,用計數(shù)板計數(shù)細胞,按1×107接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3d后觀察細胞生長情況,視情況進行傳代,一般于培養(yǎng)后10d可取第3~5代細胞按(1~5)×1 000 個/孔接種至2個96孔板中備用,每塊板上每個藥物濃度接種6個孔,設只加培養(yǎng)液的空白組和不加藥物處理的對照組。每位患者均重復檢測3次。

        1.3.2 藥物處理 96孔板中細胞培養(yǎng)24h后,以培養(yǎng)基稀釋藥物,將濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL苦參堿分別加入相應培養(yǎng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于藥物處理24、48h后用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

        1.3.3 MTT法檢測 培養(yǎng)24、48h后,每孔加入5mg/mL的MTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液,每孔加入150μL二甲基亞砜,室溫振蕩10min,在酶標儀上測定490nm處吸光度值(A值)。每孔減去空白對照A值均值后計算每組平均數(shù),抑制率(%)=(1-處理組A值/對照組A值)×100%。

        1.4 統(tǒng)計學處理 采用軟件SPSS16.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析,平均數(shù)以表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果 7例患者的關節(jié)滑液經(jīng)處理后均成功獲得大量成纖維樣細胞,經(jīng)鑒定該細胞為CD68陰性細胞[3],即人成纖維樣滑膜細胞,傳代至第3~5代時90%以上細胞為該類細胞。人成纖維樣滑膜細胞多為長梭形,胞質(zhì)透亮、均勻,細胞輪廓清晰,見較多分裂期細胞,表明細胞狀態(tài)良好,適合后續(xù)研究。

        2.2 苦參堿處理后細胞形態(tài)變化 苦參堿作用于細胞后,細胞的數(shù)量減少,細胞間的連接減少乃至消失,胞體變小,細胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu),并隨著藥物濃度的增加和處理時間的延長,空泡增加。見圖1。

        圖1 不同濃度苦參堿處理后的人成纖維樣滑膜細胞形態(tài)(×200)

        2.3 MTT法檢測結(jié)果 苦參堿處理后,處理組各濃度的A值低于對照組,其中處理24h后的1.6、2.0mg/mL濃度,處理48h后1.2、1.6、2.0mg/mL濃度的 A值明顯低于對照組,比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。各組細胞抑制率為2.52%~25.74%,隨藥物濃度增加和處理時間延長,抑制作用增強。見圖2。

        表1 苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞生長的影響()

        表1 苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞生長的影響()

        注:*表示與對照組比較的t、P值。

        組別24h A值 t* P*48h A值 t* P*對照組(mg/mL)0.522 0 ±0.057 0 處理組(mg/mL)0.4 0.507 1 ±0.077 4 0.334 0.744 0.504 0 ±0.064 3 0.553 0.590 0 .8 0.475 9 ±0.078 5 1.121 0.284 0.485 3 ±0.057 3 1.199 0.254 1 .2 0.456 0 ±0.079 6 1.613 0.133 0.440 4 ±0.064 6 2.505 0.028 1 .6 0.428 9 ±0.079 1 2.304 0.040 0.402 6 ±0.072 3 3.429 0.005 2 .0 0.412 9 ±0.074 6 2.797 0.016 0.387 6 ±0.074 3 0.520 2 ±0.006 9 3.796 0.003

        圖2 不同濃度苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞增殖的影響

        3 討 論

        RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病,病因復雜。研究表明人成纖維樣滑膜細胞過度增生和分泌是RA發(fā)病的重要基礎,參與關節(jié)的炎性反應和關節(jié)破壞。人成纖維樣滑膜細胞可表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細胞的特征,呈類腫瘤細胞樣異常增殖,侵入到軟骨和軟骨下的骨質(zhì),并產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎性細胞因子及抗炎性細胞因子、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等。因此抑制人成纖維樣滑膜細胞的增殖和活化是目前研究RA的熱點,可能為臨床上治療RA提供新的思路或靶點。

        苦參堿是苦參根部分離的一種生物堿,具有抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常、抗炎等作用[4]。其不良反應較少,目前主要用于抗病毒性肝炎治療。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制食管癌、胃癌SGC-7901細胞、前列腺癌 PC-3M 細胞等腫瘤細胞的增殖[5-7]。人成纖維樣滑膜細胞具有腫瘤細胞樣異常增殖的特性,故本研究擬探討苦參堿是否能影響人成纖維樣滑膜細胞的生長。結(jié)果表明,人成纖維樣滑膜細胞經(jīng)不同濃度的苦參堿處理后,細胞生長均受到不同程度的抑制,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,抑制作用增強。其中處理24h后的1.6、2.0mg/mL濃度,處理48h后1.2 、1.6、2.0mg/mL濃度,與對照組細胞的A值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示苦參堿能抑制人成纖維樣滑膜細胞的增殖。

        滑膜增生是RA的特征性病理表現(xiàn),增生的滑膜可形成血管翳依附于軟骨表面,介導骨和軟骨的破壞,人成纖維樣滑膜細胞凋亡不足與滑膜增生有關[8]。介導人成纖維樣滑膜細胞凋亡可能是治療RA的有效途徑。有研究顯示,苦參堿能誘導宮頸癌Hela細胞凋亡,其作用機制可能與抑制survivin基因的表達有關[9]。李海軍等[10]發(fā)現(xiàn)苦參堿能通過上調(diào)Fas蛋白的表達促進乳腺癌 MCF-7細胞凋亡。而范悅等[11]研究提示苦參堿能誘導肝癌HepG2發(fā)生自噬作用。自噬和凋亡均可導致細胞死亡、細胞數(shù)目減少,本研究通過光鏡和MTT法檢測苦參堿對人成纖維樣滑膜細胞的生長具有抑制作用,但細胞數(shù)目的減少是自噬還是凋亡導致的結(jié)果有待進一步探討??傊?,苦參堿可影響人成纖維樣滑膜細胞的生長,可作為治療RA的潛在藥物。

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        [10]李海軍,王俊明,田亞汀,等.苦參堿對 MCF-7細胞Fas、VEGF及端粒酶活性的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33(9):1247-1251.

        [11]范悅,王世明,石青青.苦參堿對肝癌細胞增殖及其細胞自噬的影響[J].中國當代醫(yī)藥,2013,20(7):11-13.

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