柴軍輝，張占東，馬 奇，花亞偉

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 胃腸外科 河南 鄭州 450052;2.河南省腫瘤醫(yī)院 普外科 河南 鄭州450003)

隨著社會的發(fā)展及人們生活方式的改變，胃癌的發(fā)病率較以往明顯增長，我國胃癌患病及死亡率均超出世界平均水平的兩倍，約每3 min就有1名中國人死于胃癌［1］，與此同時，胃癌的治療水平也在不斷改進，目前我國治療胃癌的主要方案包括根治性手術(shù)、放療化療、介入治療、生物治療以及中西醫(yī)結(jié)合等一系列抗腫瘤措施。胃癌患者術(shù)后的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率與TNM分期密切相關(guān)，準確地判斷分期是胃癌患者預(yù)后的重要依據(jù)。另外，術(shù)后系統(tǒng)的輔助治療也能夠有效地降低復發(fā)率與轉(zhuǎn)移率。

角蛋白CK是單層上皮細胞內(nèi)重要的細胞骨架成分，作為中間纖維絲蛋白家族主要成員，CK廣泛存在于上皮組織及許多上皮組織來源的腫瘤中，其表達取決于上皮組織的類型和細胞分化程度，且與腫瘤的多種特性如浸潤、轉(zhuǎn)移及藥物敏感性的改變相關(guān)，CK在上皮來源腫瘤組織中持續(xù)穩(wěn)定表達，使抗CK抗體在檢測鑒定中得以廣泛應(yīng)用［2-3］;CK18屬于低分子量蛋白，與其他角蛋白成分不同之處在于CK18上皮分布的特異性更加典型，尤其是在腺上皮來源的細胞內(nèi)［4］，因此可用于腺癌的特異性診斷。本研究旨在探索CK18的陽性表達與胃癌及周圍淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移之間的密切關(guān)系，為尋找胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，確定患者預(yù)后的高危因素及臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料:標本均取自河南省腫瘤醫(yī)院普外科2012年至2013年行胃癌手術(shù)切除的150例病例，術(shù)前行CT檢查均提示肝胃間多發(fā)淋巴結(jié)，所有患者術(shù)前均未進行任何抗腫瘤治療。其中男性86例，女性64例，年齡40～70歲，平均年齡(59.3±4.0)歲。150例胃癌患者均行D2根治術(shù)，其中有118例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(清掃淋巴結(jié)平均15個/例)，32例不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。離體標本手術(shù)切除后立即置于液氮中(不超過2 h)，之后轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱保存。在做病理診斷時，每個病例取樣本中心部位的癌組織以及鄰近淋巴結(jié)8～15個。

1.1.2 主要儀器設(shè)備、試劑:LEICA SM2010R切片機(上海萊卡儀器有限公司)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS)，101型電熱干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，原位雜交儀 ThermoBriteTM(StatSpin，USA)，全自動多功能組織病理檢測系統(tǒng)Ventana Bench Mark XT，配套試劑盒Ultra View Universal DAB Detection Kit(包含 Ultra View Universal DAB inhibitor、Ultra View Universal DAB Chtomogen、Ultra View Universal HRP Multimer、Ultra View Universal DAB H2O2、Ultra View Universal DAB Copper)，4℃冰箱保存;一抗:Anti-Her-2/neu(4B5)購自德國羅氏診斷有限公司;人細胞角蛋白18試劑盒(Human cytokeratin 18，CK-18 ELISA KIT)，購自上海勁馬實驗設(shè)備有限公司。

1.1.3 試劑有效性驗證:核對所有試劑的貨號、有效期、克隆號等相關(guān)數(shù)據(jù)并記錄;用已知的陽性對照組織測試所有的試劑;由專門負責質(zhì)量控制的醫(yī)生評價檢測抗體的有效性。

1.2 檢測方法 選取不同類型的胃癌組織，伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分別進行免疫組化染色。以CK18表達陽性或陰性為依據(jù)分組，具體步驟如下:①將制備好的組織芯片石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次后水化。②PBS洗片3×3 min。③將組織芯片切片進行抗原修復。④加入3%過氧化物酶阻斷劑，37℃ 15 min。⑤PBS洗片3×3 min。⑥加入封閉液，37℃ 10 min。⑦分別滴加一抗，置于濕盒中4℃過夜。⑧滴加生物素標記的二抗，37℃15 min。⑨滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃ 15 min。⑩滴加DAB顯色，經(jīng)蘇木素復染、返藍、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。

1.3 判定標準 免疫組化陽性表達的定性判斷，著色區(qū)表現(xiàn)為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，對應(yīng)弱(+)、中(++)、強(+++)3 級。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CK18表達與患者年齡性別的相關(guān)性 在胃癌組織伴或不伴有癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，CK18的表達率與患者的性別和年齡無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 CK18表達與胃癌組織學類型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 胃癌原發(fā)組織中CK18的陽性表達與組織類型無關(guān)(χ2=1.44，P ＞0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌組織類型無關(guān)(χ2=3.94，P ＞0.05)，CK18 在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達與胃癌組織類型無關(guān)(χ2=0.88，P＞0.05)。見表 2、表3。

表1 CK18表達與患者年齡性別的相關(guān)性分析(n)

表2 CK18表達與組織學類型的相關(guān)性分析(n，%)

表3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)中CK18的表達與不同組織學類型的相關(guān)性分析(n)

2.3 CK18表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中CK18陽性表達率要高于無癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.92，P ＜0.01)，見表4。

表4 CK18表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析(n，%)

2.4 CK18表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)的相關(guān)性根據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)胃癌TNM分期指南，依據(jù)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的個數(shù)分為N0(0個)、N1(1～2個)、N2(3～6個)、N3(7個及以上)。所選病例中未發(fā)現(xiàn)N3病例。結(jié)果中N1與N2進行比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.75，P ＜0.01)，即在胃癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CK18的表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的個數(shù)相關(guān)，見表5。

表5 CK18表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)的相關(guān)性(n，%)

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移按照目前學術(shù)界公認的分類應(yīng)包括4種:病理HE染色認定的病灶≥2 mm，稱為轉(zhuǎn)移(metastasis，M);0.2 mm＜ 病灶 ＜2 mm的稱為微轉(zhuǎn)移(micrometastasis，MM);病灶≤0.2 mm 的稱為亞顯微轉(zhuǎn)移［5-6］;單個淋巴結(jié)僅有1個轉(zhuǎn)移癌細胞則被稱為冬眠癌細胞;而微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和孤立冬眠腫瘤細胞往往是癌癥患者復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的潛在因素［7-8］。常規(guī)病理檢查與診斷對癌轉(zhuǎn)移不夠靈敏，小于0.2 mm的癌轉(zhuǎn)移灶不容易被發(fā)現(xiàn)，而且微小的轉(zhuǎn)移灶，甚至孤立的冬眠腫瘤細胞很可能在切片過程中被漏掉。研究證明，對胃癌周圍淋巴結(jié)行免疫組化檢測，會有近50%的較小癌轉(zhuǎn)移灶被漏診［9］。因此根據(jù)常規(guī)病理結(jié)果，患者術(shù)后的病理分期常常存在相對誤差，從而導致術(shù)后的其他輔助治療不夠完善。

研究發(fā)現(xiàn)CK18在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中均有較高水平的表達。本研究150例病理檢查報告中，118例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，N1期CK18陽性表達率為78.85%，N2期的表達率為96.97%;兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);另外CK18的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的個數(shù)存在相關(guān)性，即轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)越多，在腫瘤浸潤程度相同的情況下，腫瘤的TNM分期越晚，CK18的表達水平也越高。

在分子水平上，CK18分子量較小，是一種中間絲蛋白，為細胞蛋白骨架的一部分，是上皮性腫瘤較特異的免疫組化標志，陽性顆粒主要位于細胞漿，在惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生過程中，它持續(xù)存在于上皮細胞腫瘤內(nèi)，而在正常淋巴結(jié)的細胞、外周血以及骨髓等造血細胞中，CK18的表達是微乎其微的;另外在胃癌中CK18的mRNA呈高表達，而在正常外周血和正常淋巴結(jié)中不表達［10］。因此，在臨床病理檢驗中，檢測淋巴結(jié)組織中CK18的表達，可協(xié)助診斷淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來針對CK18的研究日漸增多，血清中CK18的表達常伴隨腫瘤遠處的轉(zhuǎn)移［11-12］，研究證實，在外周血及骨髓中如果檢測到CK的表達，則認為可能已經(jīng)發(fā)生腫瘤遠處的轉(zhuǎn)移。

另外，自20世紀30年代“瓦伯格效應(yīng)”(腫瘤和正常成體組織存在代謝差異，它們通過糖酵解產(chǎn)能，并生成大量的副產(chǎn)品—乳酸)的提出，針對腫瘤細胞的代謝，國內(nèi)外進行了大量的研究，據(jù)美國紐約冷泉港實驗室(CSHL)稱腫瘤細胞的糖酵解途徑加強，其中丙酮酸激酶2的蛋白促進了這一代謝過程，對腫瘤的形成及生長起著至關(guān)重要的作用，CK18的表達參與了構(gòu)成腫瘤細胞代謝所需的微環(huán)境，這種微環(huán)境能夠激活單羧基轉(zhuǎn)運體MCT1和MCT4以及細胞內(nèi)普遍存在的Na+-H+交換器［13］，使腫瘤細胞糖酵解相關(guān)酶類不致失活，而且這種環(huán)境使得糖酵解關(guān)鍵酶-丙酮酸脫氫酶激酶的表達量增多，從而保證腫瘤細胞的正常代謝。由此可見，CK18在腫瘤轉(zhuǎn)移的代謝過程中發(fā)揮重要的作用。

最近Oyama研究小組對胃癌患者血清中的CK18進行了跟蹤，其中隨訪時間平均為26.5個月(4.5～40.5 個月)，總生存期平均為 20.4 個月(1.4 ～40.5個月)，發(fā)現(xiàn)如果患者血清中的CK18水平越高，其生存時間就越短［11］。在今后的研究中我們將繼續(xù)對胃癌術(shù)后患者進行定期隨訪，評估組織樣本中CK18表達水平同患者術(shù)后生存期的相關(guān)性，進一步揭示CK18動態(tài)變化與胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討對胃癌療效觀察和預(yù)后評估的臨床應(yīng)用價值。綜上所述，檢測腫瘤組織以及淋巴結(jié)組織內(nèi)CK18陽性表達率將有助于我們重新認識腫瘤的預(yù)后情況，CK18可作為一種用來描述腫瘤患者預(yù)后情況的新指標。

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