魏 婕，王旭裕，王向輝，林 強(qiáng)，王愛民，楊建新

(1.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;海南省精細(xì)化工工程技術(shù)研究中心;海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口570228;2.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南海口571158)

近年來，生物污損問題已嚴(yán)重制約了海洋資源與能源的開發(fā)利用.海洋污損生物也稱海洋附著生物，是生長(zhǎng)在船底和海洋固定設(shè)施表面的動(dòng)物、植物和微生物［1］.海洋污損會(huì)堵塞水下管道;損壞儀器設(shè)備;加速金屬表面腐蝕.被污損生物大量附著的船舶往往自重增加、船體底面粗糙度增大、航速降低、油耗增加，迫使船舶頻繁整修，故防污問題受到了人們的極大關(guān)注［2－4］.

在眾多防污方法中，涂覆防污涂料是最為經(jīng)濟(jì)、便捷的方法.其主要作用機(jī)理是通過漆膜中防污劑的逐步滲出，抑制海洋污損生物附著生長(zhǎng)，以達(dá)到防止海洋生物污損的目的.早期傳統(tǒng)防污涂料以Cu2O為主要成份，其毒劑大量富集在生物體內(nèi)，并通過食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)人類健康造成威脅.20世紀(jì)70年代開發(fā)的有機(jī)錫防污涂料具有較強(qiáng)的毒性，即使百億分之幾的濃度也足以造成海洋生物的畸形，因此，該涂料在2008年被全面禁用.為此，異噻唑啉酮類衍生物被作為殺菌劑而應(yīng)用于許多行業(yè)，尤其是作為綠色防污劑而得到了廣泛認(rèn)可［5－6］.此類化合物具有抑菌能力強(qiáng)、應(yīng)用計(jì)量小、普適、低毒等優(yōu)點(diǎn)，它對(duì)于促進(jìn)海洋資源與能源的開發(fā)利用以及保護(hù)海洋的生態(tài)環(huán)境具重大的意義.

由于藤壺具有較強(qiáng)的繁殖能力和廣泛的分布，因此它已成為最主要的海洋污損生物之一.目前，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者把藤壺作為防治海洋生物污損的重要研究對(duì)象［7－8］.Sasikumar等人對(duì)多種海洋常見的污損動(dòng)物進(jìn)行了測(cè)試，分析了它們對(duì)石油、重金屬、碳水化合物、清潔劑及多種有機(jī)化合物的敏感性，通過比較認(rèn)為藤壺幼蟲最適宜作為防污實(shí)驗(yàn)的材料［9］.

在此前工作中，筆者設(shè)計(jì)合成了一系列苯并異噻唑啉酮類衍生物，并測(cè)試了這些化合物對(duì)細(xì)菌及真菌的抑制活性［10－13］.結(jié)果表明，合成的化合物對(duì)于細(xì)菌及真菌均有優(yōu)良的抑制活性，具有進(jìn)一步開發(fā)成為新型環(huán)保防污涂料的潛力.因此，本文在此前工作的基礎(chǔ)上，選取藤壺二期無(wú)節(jié)幼蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物對(duì)藤壺的毒性效應(yīng)，并結(jié)合淺海掛板實(shí)驗(yàn)，考察了其防污性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 體視顯微鏡:北京泰克儀器有限公司;LED光源;培養(yǎng)皿;瓷磚(300 mm×150 mm×3 mm);網(wǎng)紋藤壺Ⅱ期無(wú)節(jié)幼蟲;新取海水;二甲基亞砜(分析純);B04－10白啞光丙烯酸磁漆(廣西北海市造漆廠);天那水(?？谑胁刍S).

1.2 合成實(shí)驗(yàn) 2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物是由固體三光氣、脂肪醇和苯并異噻唑啉酮(BIT)為原料而合成［14］，具體合成路線如下:

圖1 目標(biāo)化合物合成路線

1.3 藤壺的生物活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 成體藤壺的采集與幼蟲的繁殖 新取的海水經(jīng)過濾、高壓滅菌備用.藤壺采自廢棄木船底部，并選擇個(gè)體較大的藤壺成體以便繁殖幼蟲.將采集好的藤壺清洗干凈，刷去表面淤泥和其他海洋生物，放入裝有新鮮海水的燒杯中，陽(yáng)光照射刺激1 h后，可獲得大量藤壺一期和二期的無(wú)節(jié)幼蟲，培養(yǎng)3 h后，即可得到藤壺的二期無(wú)節(jié)幼體.根據(jù)藤壺幼蟲的趨光性，以LED燈作為光源，用滴管小心吸取趨光性良好的藤壺幼蟲，肉眼觀察，確定幼蟲個(gè)數(shù)，將其轉(zhuǎn)移到盛有新鮮海水的小燒杯中，控制其密度不超過5只/mL，供實(shí)驗(yàn)用.

1.3.2 藤壺幼蟲急性毒性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物10 mg，溶于10 mL DMSO中，用過濾滅菌后的新鮮海水稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為5、4、3、2、1 mg/L的受試溶液，并設(shè)BIT、含等量濃度的DMSO溶液和海水作為對(duì)照組.每個(gè)化合物共8組實(shí)驗(yàn)，每組均設(shè)3個(gè)平行樣.用滴管小心吸取藤壺幼蟲，用與各組實(shí)驗(yàn)濃度相同的毒液潤(rùn)洗后再放入培養(yǎng)皿中，確保實(shí)驗(yàn)組藥物濃度的準(zhǔn)確性.每個(gè)培養(yǎng)皿中藤壺二期無(wú)節(jié)幼蟲數(shù)為30只，分別在投入幼蟲12 h、24 h后用體視顯微鏡觀察，并記錄死亡幼蟲個(gè)數(shù).實(shí)驗(yàn)期間，避光加蓋、不投餌、不通氣.

實(shí)驗(yàn)以國(guó)內(nèi)外廣泛使用的“停止游動(dòng)”現(xiàn)象作為判斷藤壺幼蟲死亡的標(biāo)準(zhǔn).觀察時(shí)，輕搖培養(yǎng)皿，如果沉到培養(yǎng)皿底部的藤壺幼蟲停止游動(dòng)和附肢停止振動(dòng)(15秒以上)，則認(rèn)為已經(jīng)死亡，記錄后將確認(rèn)死亡的幼蟲吸出［15］.

1.4 淺海掛板實(shí)驗(yàn) 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“淺海掛板試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)”(GB/T 5370—2007)進(jìn)行海洋掛板實(shí)驗(yàn)，對(duì)所制備的防污涂料的防污性能進(jìn)行了考察［16］.

選取2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物a、c、e、f進(jìn)行淺海掛板實(shí)驗(yàn).根據(jù)油漆固含量將化合物配制成質(zhì)量濃度為0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料，并以BIT及空白樣板做對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)樣板采用瓷磚(300 mm×150 mm×3 mm)，以避免海水對(duì)材料表面腐蝕，從而消除了腐蝕干擾.用天那水做溶劑，以丙烯酸磁漆為成膜劑，配制不同質(zhì)量濃度的防污涂料.瓷磚表面洗凈后，涂刷兩道自制防污涂料，室溫晾干至固化完全.實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為海南省?？谑惺兰o(jì)大橋北端淺海，沿岸礁石附著有大量藻類、石灰蟲、網(wǎng)紋藤壺、牡蠣等污損生物.將實(shí)驗(yàn)樣板做好顯著標(biāo)識(shí)，固定于框架中，樣板浸海深度為1 m.

實(shí)驗(yàn)板浸入淺海后，需定期檢查、記錄和拍照.觀察前小心清洗樣板，除去板上淤泥，并注意不得損壞防污漆膜;觀察后盡快將樣板放回原處，避免已附著生物死亡而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.最后，根據(jù)樣板表面的附著生物種類及數(shù)量評(píng)價(jià)防污性能.

2 結(jié)果與討論

2.1 藤壺幼蟲急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)，分析各化合物對(duì)藤壺幼蟲的急性毒性效應(yīng).以受試化合物濃度為橫坐標(biāo)，并以12 h以及24 h藤壺幼蟲的死亡率為縱坐標(biāo)，分別作圖:

圖2 化合物對(duì)藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)（12 h）

圖3 化合物對(duì)藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)（24 h）

從上圖可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，各化合物對(duì)藤壺幼蟲均有一定的毒性作用，且毒殺效果均優(yōu)于對(duì)照組BIT.從圖2(12 h)可看出，化合物c的質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，藤壺的死亡率僅為1.1%，但質(zhì)量濃度為4 mg/L時(shí)，其死亡率已達(dá)100%，也就是說，在1～4 mg/L之間，化合物c對(duì)藤壺的毒性效應(yīng)急速增加.與之相比，24 h(圖3)時(shí)，當(dāng)化合物e的質(zhì)量濃度為1 mg/L，藤壺幼蟲的死亡率已超過75%，可見，化合物e質(zhì)量濃度在0～1 mg/L之間時(shí)，藤壺幼蟲對(duì)其極為敏感，微量毒劑就已有明顯毒殺效果.此后，隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，死亡率緩慢上升.由此可以得出，藤壺幼蟲對(duì)不同化合物質(zhì)量濃度區(qū)間的敏感性存在差異，毒性效應(yīng)隨化合物質(zhì)量濃度的增加呈兩種不同趨勢(shì):毒性快速增強(qiáng)趨勢(shì)和毒性緩慢增加趨勢(shì).就所有化合物而言，無(wú)論是12 h，還是24 h，隨化合物質(zhì)量濃度的增加，藤壺幼蟲的死亡率均升高，各化合物對(duì)藤壺幼蟲的毒性效應(yīng)增強(qiáng).在相同實(shí)驗(yàn)條件下，12 h的有效致死率均小于24 h的有效致死率，說明隨時(shí)間的推移，各化合物對(duì)藤壺的毒性作用不斷增強(qiáng).

采用概率單位法計(jì)算藤壺二期無(wú)節(jié)幼蟲的半致死濃度(LC50)，將濃度換算成對(duì)數(shù)值，各濃度對(duì)應(yīng)的死亡發(fā)生頻率換算成概率單位，通過化合物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)和死亡概率單位的線性回歸，做回歸直線.當(dāng)概率單位為5時(shí)，所對(duì)應(yīng)的值即為L(zhǎng)C50的對(duì)數(shù)，查詢反對(duì)數(shù)表，得各化合物對(duì)藤壺二期無(wú)節(jié)幼蟲的半致死濃度(LC50)［17］，數(shù)值見下表:

從表1可看出，所設(shè)計(jì)合成的6個(gè)苯并異噻唑啉酮類衍生物對(duì)藤壺幼蟲均有一定的毒性作用，且毒殺效果優(yōu)于BIT.隨時(shí)間推移，毒性作用增加，24 h藤壺幼蟲LC50僅為12 h的一半左右.根據(jù)上表LC50數(shù)值可看出，隨化合物取代基中碳原子數(shù)目的增加，LC50逐漸減小，即殺死50%的藤壺幼蟲所需的化合物質(zhì)量濃度逐漸降低.推測(cè):受試化合物對(duì)藤壺的毒性作用與其結(jié)構(gòu)存在一定的關(guān)系，碳原子數(shù)目增加，有利于毒性作用的增強(qiáng).

表1 9種有機(jī)化合物對(duì)網(wǎng)紋藤壺Ⅱ期無(wú)節(jié)幼蟲的LC50

2.2 淺海掛板實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取LC50值有明顯差異的a、c、e、f 4個(gè)化合物進(jìn)行淺海掛板實(shí)驗(yàn).以BIT以及空白樣板作為對(duì)照，根據(jù)油漆固含量配制質(zhì)量濃度為0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料.海洋掛板實(shí)驗(yàn)90 d后，取出實(shí)驗(yàn)板拍照，結(jié)果如圖4所示:

圖4 浸海實(shí)驗(yàn)樣板照片

化合物a具有良好的防污性能，其質(zhì)量濃度為0.01%(圖a－1)時(shí)，有少量藤壺附著.增加質(zhì)量濃度到0.05%(圖a－2)時(shí)，僅有少量藻類沉積.當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)0.1%(圖a－3)時(shí)，板面光滑，未見任何污損生物附著.化合物c也具有優(yōu)良的防污效果，浸海90 d后，實(shí)驗(yàn)板表面少有污損生物附著，且防污性能隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng).化合物e對(duì)海洋污損生物的抑制作用較好，其質(zhì)量濃度為0.01%時(shí)(圖e－1)，有少量污損生物附著生長(zhǎng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)0.1%(圖e－3)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)污損生物，防污效果可達(dá)要求.化合物f的質(zhì)量濃度低于0.05%(圖f－1、f－2)時(shí)，有較多藤壺附著，當(dāng)增大質(zhì)量濃度至0.1%(圖f－3)時(shí)，對(duì)污損生物有較好的抑制作用.對(duì)照組空白樣板(KB)以及化合物BIT樣板經(jīng)過90 d的海水浸泡后，表面均出現(xiàn)了藤壺、牡蠣、石灰蟲等大量污損生物附著.

淺海掛板實(shí)驗(yàn)表明:合成化合物取代基不同，對(duì)污損生物的抑制作用也不同，且防污性能隨化合物質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1%時(shí)，少有污損生物附著，其90 d的防污效果基本可達(dá)要求.各化合物防污效果明顯優(yōu)于空白樣板及同濃度下的BIT樣板，因此，2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物比BIT具有更優(yōu)良的防污性能，以上結(jié)論與藤壺急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符.

3 結(jié)論

本文研究了6個(gè)2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物對(duì)藤壺二期無(wú)節(jié)幼蟲的急性毒性效應(yīng)，并選取其中毒殺效果較好的4個(gè)化合物進(jìn)行淺海掛板實(shí)驗(yàn).

藤壺毒性實(shí)驗(yàn)表明:各化合物對(duì)藤壺幼蟲均具有一定的毒性作用，且毒殺效果隨化合物質(zhì)量濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高.藤壺幼蟲對(duì)不同化合物質(zhì)量濃度區(qū)間的敏感性存在差異.毒性效應(yīng)隨化合物質(zhì)量濃度的增加呈毒性快速增強(qiáng)的趨勢(shì)或毒性緩慢增加的趨勢(shì).LC50數(shù)據(jù)表明，隨化合物取代基中碳原子數(shù)目的增加，LC50逐漸減小，毒性作用逐漸增強(qiáng).

淺海掛板實(shí)驗(yàn)表明:化合物的不同取代基對(duì)污損生物的抑制效果存在差異，其防污性能隨化合物質(zhì)量濃度的增加而提高，質(zhì)量濃度為0.1% 時(shí)，防污效果基本可達(dá)要求，與藤壺毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物比BIT具有更優(yōu)良的防污性能，有進(jìn)一步開發(fā)成為新型海洋防污涂料的潛力.

致謝

感謝海南省精細(xì)化工工程中心，海南大學(xué)分析測(cè)試中心，海南大學(xué)海洋學(xué)院對(duì)本文的支持.

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