馬永強(qiáng)，姬文婕，鄭春秀，張譯丹，彭守春，胡道川，陳雪芬，周 欣，魏路清

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性進(jìn)行性纖維化型間質(zhì)性肺炎，病程不可逆且預(yù)后極差，近年來IPF的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1－2］。目前其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但炎癥和免疫機(jī)制的觀點(diǎn)仍發(fā)揮重要作用［3］。單核細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫細(xì)胞，在炎癥及免疫反應(yīng)中扮演重要角色。小鼠主要存在2種循環(huán)單核細(xì)胞亞群，分別為Ly6ChiCCR2+CX3CR1－和 Ly6CloCCR2－CX3CR1+亞群，Ly6Chi單核細(xì)胞為炎癥性亞群［4］。單核細(xì)胞亞群的變化與疾病發(fā)展階段有密切關(guān)系［5］，本研究以博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化為模型，闡述在早期炎癥和后期纖維化病理進(jìn)程中，不同單核細(xì)胞亞群比例的變化特點(diǎn)，分析Ly6Chi單核細(xì)胞比例變化與早期炎癥反應(yīng)程度和后期纖維化指標(biāo)的相關(guān)性，從而探討單核細(xì)胞表型偏移在肺纖維化發(fā)病過程中的作用及意義，為肺纖維化的基礎(chǔ)和臨床研究提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡(16～18g)，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004。小鼠在光照良好、通風(fēng)、溫度和濕度適宜的清潔級(jí)動(dòng)物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。注射用鹽酸平陽霉素(天津太河制藥有限公司)，F(xiàn)luorescein isothiocyanate(FITC)anti-mouse Ly6C抗體、Phycoerythrin(PE)anti-mouse CD11b抗體(Biolegend公司)，F(xiàn)ITC anti-Rat IgG2c抗體，PE anti-Rat IgG2b抗體，RNAiso Plus(TaKaRa)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Rnasin Inhibitor(Promega 公 司)，SYBR Green Master(Roche公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備和標(biāo)本的采集 100只雄性C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字列表法分為博萊霉素組和等滲鹽水組，每組50只。參照Lakatos等［6］經(jīng)口咽吸入法制備肺纖維化模型，博萊霉素組小鼠緩慢注入40 μL博萊霉素A5(2 mg/kg)，等滲鹽水組小鼠注入相同體積無菌等滲鹽水。分別于術(shù)后第1、3、7、14和21天，輕度麻醉后，放血處死，EDTA 抗凝血并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);采集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類;未灌洗小鼠右肺用于檢測(cè)膠原Ⅰ、Ⅲ的mRNA表達(dá)水平，左肺行病理學(xué)檢測(cè);灌洗小鼠肺組織用于羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量的測(cè)定。

1.2.2 小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè) 肺組織在真空負(fù)壓條件下(15～20英寸汞柱，1英寸汞柱=3.386kPa)經(jīng)4%多聚甲醛(pH 7.2 ～7.4)固定 24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋，切片厚度為5 μm。按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色和Masson染色。參照Szapiel等［7］方法進(jìn)行炎癥評(píng)分，每只小鼠選取3張連續(xù)切片，10×10倍觀察5個(gè)視野，避開大的支氣管和血管進(jìn)行評(píng)分，0分:正常組織，1分:炎性細(xì)胞浸潤面積占肺組織面積比例＜20%，2分:比例為20% ～50%，3分:比例 ＞50%。取其平均值作為炎癥評(píng)分，代表肺組織的炎癥程度。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)肺間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行分析，膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)代表肺纖維化程度，計(jì)算公式如下:

CVF=膠原面積/(圖像總面積－空白區(qū)域面積)

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類 BALF常規(guī)離心、重懸細(xì)胞，通過Count Star自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞總數(shù);常規(guī)甩片、固定及HE染色，光學(xué)顯微鏡(Nikon E600POL)下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例。

1.2.4 小鼠肺組織膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平檢測(cè) 液氮研磨肺組織，Trizol法提取肺組織總RNA，甲醛變性電泳法檢測(cè)RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，引物如下:膠原I(正義鏈:5'-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3'，反義鏈:5'-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 94 bp。膠原Ⅲ(正義鏈:5'-TCCCCTGGAATCTGTGAATC-3'，反義鏈:5'-TGAGTCGAATTGGGGAGAAT-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為63 bp。β-actin(正義鏈:5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，反義鏈:5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為104 bp。以上引物均由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。用2－ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 小鼠肺組織HYP含量測(cè)定 小鼠肺組織稱重，制備成組織勻漿，按照試劑盒說明書酸水解法水解肺組織，氯胺T法測(cè)定肺組織HYP含量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例新鮮 EDTA 抗凝血 100 μL 加入 0.25 μg FITC antimouse Ly6C和0.25μg PE anti-mouse CD11b抗體混勻，用相同體積的FITC anti-Rat IgG2c抗體及PE anti-Rat IgG2b抗體設(shè)置同型對(duì)照;室溫避光孵育15 min;加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后避光靜置10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀分析時(shí)的設(shè)門策略:首先在FSC-SSC散點(diǎn)圖中，選定SSClo群，然后識(shí)別FSC/CD11b+細(xì)胞，最后根據(jù)該群Ly6C熒光強(qiáng)度劃分為Ly6Chi和Ly6Clo。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)量資料滿足正態(tài)性及方差齊性，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及SNK法兩兩比較。不滿足正態(tài)性或方差齊性，以中位數(shù)、四分位間距描述原始數(shù)據(jù)，并采用非參數(shù)秩和Mann-Whitney檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 等滲鹽水組小鼠肺組織HE染色均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔基本正常，肺泡結(jié)構(gòu)無破壞。而博萊霉素組第3天開始出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，肺泡間隔增厚，第7天炎癥反應(yīng)加重，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，炎癥評(píng)分為(2.53±0.08)分，而后炎性細(xì)胞浸潤減少，出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生和膠原沉積。Masson染色結(jié)果顯示，等滲鹽水組各時(shí)間點(diǎn)均未見明顯膠原沉積。而博萊霉素組第7天出現(xiàn)少量藍(lán)染的膠原纖維，第14天膠原纖維含量明顯增多，后膠原沉積持續(xù)加重，直至第21天，可見大量致密的藍(lán)色膠原纖維。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理染色結(jié)果Figure 1 Results of pathological staining of the mouse lung tissue at different times

2.2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)結(jié)果 等滲鹽水組不同時(shí)間點(diǎn)BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與等滲鹽水組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，博萊霉素組BALF細(xì)胞總數(shù)第3 天明顯增多(25.18 ±2.06 vs 8.82 ±1.59，P ＜0.01)，第7 天升至高峰(56.56 ±5.03 vs 3.68 ±0.79，P＜0.01)，后呈下降趨勢(shì)，第14、21天細(xì)胞總數(shù)仍高于等滲鹽水組(P＜0.01);肺泡巨噬細(xì)胞比例的變化趨勢(shì)與細(xì)胞總數(shù)相一致;與等滲鹽水組相比，博萊霉素組中性粒細(xì)胞總數(shù)第1、3、7天顯著高于等滲鹽水組(9.086 ±1.268 vs 1.108 ±0.229、5.551 ±0.511 vs 0.315 ±0.100、8.093 ±0.922 vs 0.249 ±0.074)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而后呈下降趨勢(shì)，第14、21天中性粒細(xì)胞數(shù)與等滲鹽水組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠肺組織膠原Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)水平的變化 與等滲鹽水組相比，博萊霉素組第14天和第21天膠原Ⅰ、ⅢmRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

2.4 各組小鼠肺組織HYP含量的變化 等滲鹽水組不同時(shí)間點(diǎn)HYP含量相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與各組小鼠肺組織Masson染色膠原容積分?jǐn)?shù)計(jì)算結(jié)果相一致，與等滲鹽水組相比，博萊霉素組第7、14、21天HYP含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。博萊霉素組內(nèi)兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.5 各組小鼠不同單核細(xì)胞亞群比例的變化 循環(huán)Ly6Chi單核細(xì)胞比例在博萊霉素致肺損傷后迅速升高，出現(xiàn)高峰時(shí)間(第3天)早于肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及BALF細(xì)胞總數(shù)達(dá)到峰值的時(shí)間(第7天)，在纖維化進(jìn)展期Ly6Chi單核細(xì)胞比例較早期明顯降低。與等滲鹽水組比較，給予C57BL/6J小鼠博萊霉素干預(yù)后第1天Ly6Chi單核細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.01)，第3天達(dá)到高峰(P＜0.01)，而后逐漸下降，但第7、21天仍高于等滲鹽水組(P＜0.05)。博萊霉素組Ly6Clo單核細(xì)胞亞群比例變化與Ly6Chi變化趨勢(shì)相反。等滲鹽水組小鼠循環(huán)單核細(xì)胞Ly6Chi亞群比例占優(yōu)勢(shì)，不同時(shí)間點(diǎn)等滲鹽水組小鼠循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例變化幅度小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.6 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群與炎癥和纖維化指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系 博萊霉素干預(yù)后，循環(huán)Ly6Chi單核細(xì)胞表現(xiàn)為快反應(yīng)細(xì)胞群，第1天迅速升高，在炎癥反應(yīng)期維持較高水平。我們將各組小鼠Ly6Chi單核細(xì)胞比例分別與肺組織IS和CVF進(jìn)行相關(guān)性分析，Ly6Chi亞群細(xì)胞比例變化與IS及CVF值均呈明顯正相關(guān)(分別為 r=0.636，P ＜0.01;r=0.443，P=0.0013)。根據(jù)以上結(jié)果得知，博萊霉素組Ly6Chi的比例在第3 d達(dá)到峰值，而肺組織IS和CVF值分別于第7、21天最高，因此，將前者與后兩者分別進(jìn)行相關(guān)分析顯示，Ly6Chi(3天)比例與IS(7天)呈明顯正相關(guān)(r=0.934，P ＜0.01)，Ly6Chi(3 天)比例與 CVF(21 天)呈明顯正相關(guān)(r=0.983，P ＜0.01)。見圖3。

圖2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織炎癥評(píng)分、BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺纖維化不同指標(biāo)變化結(jié)果Figure 2 Inflammation score，cell count in the BALF and changes of pulmonary fibrosis markers in the normal saline(NS)and bleomycin(BLM)groups at different times

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)單核細(xì)胞亞群比例的變化及Ly6Chi亞群比例與炎癥評(píng)分、膠原容積分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析Figure 3 Monocyte subsets detected by flow cytometry and correlation of the percentage of Ly6Chimonocytes，with inflammation score and collage volume fraction in the normal saline(NS)and bleomycin(BLM)groups

3 討 論

IPF是彌漫性肺間質(zhì)纖維化中最常見的、致死性最高的一種。由于其發(fā)病過程的自身特點(diǎn)，很難找到有效的預(yù)防和治療方法［8］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從細(xì)胞因子水平干預(yù)及免疫調(diào)節(jié)等方面對(duì)博萊霉素致纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛探索，然而肺纖維化的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［3，9］。大量研究表明炎癥反應(yīng)的異常調(diào)節(jié)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，目前IPF仍被認(rèn)為是一種肺實(shí)質(zhì)慢性炎癥性疾?。?，10］。

循環(huán)單核細(xì)胞廣泛參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)、防御和組織重塑等過程。外周血中成熟單核細(xì)胞形態(tài)存在異質(zhì)性，不同單核細(xì)胞亞群反映了具有不同生理功能的發(fā)展階段［5］。人和小鼠血中存在2種主要的單核細(xì)胞亞群，并且有一定的相似性［11］，在小鼠中一種為Ly6ChiCCR2+CD62L+CX3CR1low，因早期招募至炎癥區(qū)域而被認(rèn)為是促炎癥表型，另一種Ly6CloCCR2－CD62L－CX3CR1hi亞群發(fā)揮巡察功能，并且可以補(bǔ)充組織固有巨噬細(xì)胞［12］。Ly6Chi單核細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化與炎癥反應(yīng)的不同階段關(guān)系密切，有研究報(bào)道，小鼠體內(nèi)C-C趨化因子水平的升高，促進(jìn)了循環(huán)及二級(jí)淋巴組織中Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例選擇性增高，在小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型中，纖維化進(jìn)展期消除以Ly6Chi為主的循環(huán)單核細(xì)胞能夠減輕纖維化程度［4，13］。

博萊霉素經(jīng)口咽吸入途徑作用于肺，循環(huán)中Ly6Chi單核細(xì)胞比例第1天明顯升高，第3天達(dá)到最高點(diǎn)隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與此相伴行，博萊霉素干預(yù)第3天，病理學(xué)結(jié)果證實(shí)肺間質(zhì)炎性細(xì)胞的浸潤、肺泡壁水腫等炎癥表現(xiàn)，在第7天時(shí)最為顯著，肺泡灌洗液的分類計(jì)數(shù)結(jié)果與肺組織病理檢測(cè)相一致。Ly6Chi單核細(xì)胞比例的變化與炎癥反應(yīng)(以IS半定量法評(píng)價(jià))呈明顯正相關(guān)。而病理學(xué)方法、蛋白及核酸水平的檢測(cè)表明，在博萊霉素干預(yù)后的不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積程度在第21天達(dá)到最高。Ly6Chi單核細(xì)胞與后期纖維化指標(biāo)存在明顯的相關(guān)關(guān)系。炎癥過程中，單核細(xì)胞在組織局部浸潤并分化的巨噬細(xì)胞至少存在2種功能互補(bǔ)的亞群［14］。第1種由典型單核細(xì)胞(Ly6Chi亞群)分化產(chǎn)生，表現(xiàn)為典型活化狀態(tài)(M1表型)，第2種由非典型單核細(xì)胞(Ly6Clo亞群)分化而來，表現(xiàn)為替代活化狀態(tài)(M2表型)。目前認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的破壞與肺纖維化的不良預(yù)后有關(guān)，M2型巨噬細(xì)胞以旁分泌的形式引起成纖維細(xì)胞細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及血管生成［15］，研究證明，在嚙齒類動(dòng)物博萊霉素模型中，肺巨噬細(xì)胞被認(rèn)為 TGF-β 的主要來源細(xì)胞［4］，而TGF-β作為一種主要的促纖維化分子，其在不同器官纖維化病理過程中的作用機(jī)制較為明確［16－17］。此外，肺組織巨噬細(xì)胞來源的多種趨化因子(如IL-8，CXCL10，CCL5 等)、炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)等細(xì)胞因子及其與不同炎性細(xì)胞之間的共同作用，引起肺間質(zhì)纖維細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，逐漸發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前Ly6Chi單核細(xì)胞亞群在炎癥調(diào)節(jié)中重要作用的結(jié)論相一致，但與博萊霉素誘導(dǎo)肺損傷中，炎癥早期消除以Ly6Chi亞群為主的循環(huán)單核細(xì)胞對(duì)隨后的纖維化進(jìn)展無明顯影響的觀點(diǎn)不同［4，13］，我們的結(jié)果表明，與肺組織炎癥細(xì)胞滲出、浸潤等病理進(jìn)程相比，Ly6Chi單核細(xì)胞亞群應(yīng)對(duì)肺組織損傷早期迅速升高，且該亞群單核細(xì)胞數(shù)量的增加與肺組織炎癥及后期纖維化評(píng)分呈明顯正相關(guān)。綜上所述，在博萊霉素A5誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，不同病理生理階段外周血中 Ly6Chi、Ly6Clo單核細(xì)胞亞群比例處于動(dòng)態(tài)變化，早期Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例的升高可能與肺組織炎癥反應(yīng)及后期纖維化程度存在密切的聯(lián)系。進(jìn)一步的研究將明確肺纖維化模型中循環(huán)及外周組織單核吞噬細(xì)胞功能表型的變化特點(diǎn)及相關(guān)關(guān)系，探討以單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)為靶點(diǎn)干預(yù)肺纖維化的治療策略。

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