張 錦，夏秋媛，王建東，周曉軍

0 引 言

EphB4是受體酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases)中最大的亞群——促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體中的一員。與其他Eph分子相比，EphB4具有重要而獨特的生物學功能。研究表明，EphB4與其配體EphrinB2相結(jié)合在血管及淋巴管發(fā)育、重塑等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1－3］。同時，EphB4也可通過調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程參與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4－5］。但 EphB4在不同類型腫瘤或同種腫瘤的不同階段發(fā)揮的作用并不相同，有時甚至完全相反［6］。為了更好地了解EphB4基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)機制，為結(jié)腸癌的基因治療提供有益的實驗依據(jù)，本研究構(gòu)建了含有EphB4基因全長片段的慢病毒載體，并進一步轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株，檢測轉(zhuǎn)染前后細胞株內(nèi)EphB4的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 SW480、Caco-2購自中科院上海細胞庫;pMD18-T vector購自Takara公司;感受態(tài)細胞DH5α、HEK293細胞、293T 細胞、platinum Pfx DNA Polymerase、platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity、pcDNA3.1(+)、慢病毒載體 pLenti6.3/V5-DEST、pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP、包裝質(zhì)粒 pLP1、pLP2 及 pLP/VSVG、Packaging Mix、lipofectamine 2000、BP clonaseⅡ、LR clonaseⅡ、蛋白酶 K、pDONR221、Opti-MEM 培養(yǎng)液、Polybrene、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Blasticidin、0.25%Trypsin、Trizol、SuperScripⅢ RT(200 U/μL)、RNase H等均購自Invitrogen公司;BamHⅠ、NotⅠ、AscⅠ購自 MBI公司;T4 DNA Ligase購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 EphB4基因序列的合成 對所需合成的EphB4基因序列進行分析，檢查基因內(nèi)部有無復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列連接。根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，分別設(shè)計合成一系列的單鏈oligo。利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因序列。將合成好的序列裝入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。測序驗證重組克隆中插入序列是否與EphB4基因序列相一致。通過重疊PCR將基因序列中突變點修復(fù)，命名為pMD18-EphB4。

1.2.2 含有EphB4基因序列的質(zhì)粒載體的構(gòu)建 應(yīng)用限制性內(nèi)切酶 NotⅠ、BamHⅠ分別對 pMD18-EphB4和載體pcDNA3.1(+)進行雙酶切，回收的基因片段和載體片段通過T4 DNA Ligase 16℃連接2h后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。測序驗證重組克隆插入片段的序列信息。質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-EphB4。

1.2.3 慢病毒表達載體的構(gòu)建 應(yīng)用AscⅠ、BamHⅠ雙酶切pcDNA3.1-EphB4質(zhì)粒及慢病毒載體pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP，通過 T4 DNA Ligase將兩者酶切后電泳回收的產(chǎn)物連接，并轉(zhuǎn)化DH5α。測序驗證重組克隆中插入片段的序列信息，并將其命名為 pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP。

1.2.4 慢病毒的包裝 取9 μg Packaging Mix和3 μg慢病毒表達質(zhì)粒 pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP加入 1.5 mL Opti-MEM，輕輕混勻后加入 lipofectamine 2000稀釋液，室溫孵育20 min制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物緩慢加入293T細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液上清，離心并過濾。將所獲含有EphB4基因序列的病毒液命名為pLenti6.3-EphB4并進行滴度測定。

1.2.5 病毒滴度的測定 HEK293細胞經(jīng)胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，細胞計數(shù)后按8000個細胞每孔的密度鋪于96孔板。按文獻［7］將病毒液用慢病毒稀釋用培養(yǎng)基(DMEM+2%FBS+8 μg/mL Polybrene)進行1∶10倍比稀釋后，各取100 μL感染96孔板中的HEK293細胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數(shù)量。每個稀釋度2個重復(fù)。

病毒滴度=各孔中表達熒光的細胞數(shù)量平均值/每孔中含有的慢病毒液體積

1.2.6 慢病毒侵染靶細胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株 靶細胞經(jīng)胰酶消化、細胞計數(shù)后按照1.5×105個/孔的密度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，換成不含血清的培養(yǎng)基，分別加入感染復(fù)數(shù)為20的慢病毒Lenti6.3-EphB4和Lenti6.3-EGFP(陰性對照)稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescene protein，GFP)的表達情況，并加入一定濃度的Blasticidin進行篩選，72 h后觀察細胞情況，后續(xù)每4～72小時更換1次含有抗生素Blasticidin的完全培養(yǎng)基。待空白孔細胞完全死亡后，繼續(xù)培養(yǎng)并適時凍存，同時收集部分細胞抽提RNA檢測EphB4 mRNA表達。設(shè)定空白的靶細胞作為對照。

1.2.7 qPCR檢測目的基因的表達情況 Trizol法提取各組細胞樣品中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過qPCR法檢測細胞樣品中目的基因EphB4、EphrinB2和內(nèi)參基因GAPDH的表達量，實驗重復(fù)3次。根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和內(nèi)參基因的域值循環(huán)數(shù)(threshold cycle number，Ct值)，采用ΔΔCt的方法對基因表達進行相對定量。以轉(zhuǎn)染陰性對照載體的樣品作為對照樣品，比較各瞬時轉(zhuǎn)染干擾載體組樣品中目的基因的表達量，并計算干擾效果。計算公式如下:

ΔΔCt=(待測樣品目的基因的Ct平均值－待測樣品內(nèi)參基因的Ct平均值)－(對照樣品目的基因的Ct平均值－對照樣本內(nèi)參基因的Ct平均值)

基因的表達量 F=2－ΔΔCt

目的基因的干擾效率=1－2－ΔΔCt

目的基因EphB4、EphrinB2及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列如下:EphB4-F:5'-CGCACCTACGAAGTGTGTGA-3'，EphB4-R:5'-GTCCGCATCGCTCTCATAGTA-3';GAPDH-F:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，GAPDH-R:5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。PCR 反 應(yīng)條件為95℃ 2min;95℃ 10s，60℃ 30s，70℃ 45s，40 個循環(huán);95℃ 30s。每個樣本重復(fù)檢測3次。

2 結(jié) 果

2.1 EphB4基因序列的合成及鑒定 人工化學合成寡核苷酸片段，通過片段連接技術(shù)將系列小片段連接成EphB4基因，裝入pcDNA3.1(+)載體進行擴增后，雙向測序結(jié)果顯示合成的EphB4序列與Gene Bank中公布的序列一致，表明成功獲得了2964 bp的EphB4基因。

2.2 慢病毒載體pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP的成功構(gòu)建 通過酶切及連接反應(yīng)將質(zhì)粒pcDNA3.1-EphB4中擴增的目的基因EphB4片段克隆裝入慢病毒表達載體pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP，構(gòu)建含有EphB4基因序列的慢病毒表達載體。經(jīng)過雙向測序，證實重組克隆中插入片段的序列信息與EphB4基因序列一致，慢病毒表達載體構(gòu)建成功。

2.3 含有EphB4基因序列的慢病毒的獲得及滴度測定 慢病毒表達載體 pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及pLP/VSVG通過脂質(zhì)體介導(dǎo)獲得了含有EphB4基因序列的慢病毒Lenti6.3-EphB4。通過稀釋計數(shù)法測得病毒滴度為1×108TU/mL。

2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的獲得及評價 病毒液Lenti6.3-EphB4和Lenti6.3-EGFP侵染靶細胞SW480及Coca-2后，根據(jù)本實驗所用的慢病毒載體中所含的抗性標志選用藥物Blasticidin對靶細胞進行篩選及維持，最終獲得了穩(wěn)定的細胞系。熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染后72 h的各組細胞均可見GFP表達。見圖1。qPCR檢測證實，與原始SW480或Caco-2細胞相比，Lenti6.3-EphB4侵染的SW480和Caco-2中EphB4表達顯著增加，而Lenti6.3-EGFP病毒轉(zhuǎn)染的SW480和Caco-2細胞中EphB4表達未見明顯變化。見圖2。

圖1 穩(wěn)定過表達EphB4的結(jié)腸癌細胞株Figure 1 Colon cancer cell lines stably overexpressing EphB4

圖2 各組細胞株EphB4 mRNA的相對含量Figure 2 Relative expression of EphB4 mRNA in different colon cancer cell lines

3 討 論

近年來對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子病理機制的深入研究為正在興起的基因治療提供了理論依據(jù)，促進了惡性腫瘤分子靶向治療的探索性研究。作為一種可能的分子治療新靶點，明確EphB4的具體功能及作用機制尤為重要。而新近分子生物學技術(shù)的發(fā)展為實現(xiàn)上述研究目的提供了可能［8］。本研究證實了經(jīng)外源性手段(如慢病毒載體介導(dǎo))將人工合成的基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達的可能性，為靶向EphB4基因治療提供了實驗依據(jù)。

實驗中選用的慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息［9］。慢病毒包裝質(zhì)粒提供所有的轉(zhuǎn)錄及包裝所需要的所有輔助蛋白。利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，可以直接用于宿主細胞的感染。目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。為了獲得穩(wěn)定過表達目的基因的細胞系，本研究進一步運用基因轉(zhuǎn)染方式把抗藥性基因引入細胞，并確定抗藥性基因跟需要篩選的目標基因受同樣的啟動子調(diào)控，然后將相應(yīng)的藥物加入到培養(yǎng)基，不表達目標基因和抗藥性基因的細胞將全部被藥物殺死，從而達到篩選的目的，獲得高度純化的陽性轉(zhuǎn)染細胞［10－11］。與通過流式細胞儀分選攜帶GFP陽性細胞的方法相比，此方法操作起來更為簡便易行，因此也是目前篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株最常用的方法。

區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其他非病毒載體，慢病毒載體對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體轉(zhuǎn)移基因片段容量大，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，能穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組;同時慢病毒在整合基因時，并不傾向于轉(zhuǎn)錄的起始位點，而是在基因的整個轉(zhuǎn)錄區(qū)都可以整合，整合的慢病毒對啟動子的激活概率更低。與其他致癌反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體不易引起插入突變［12－14］。因此本研究選用了慢病毒作為載體將外源性基因EphB4轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細胞。轉(zhuǎn)染24h及72h后，熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染含有隨機序列及轉(zhuǎn)染EphB4基因的慢病毒載體的各組細胞中均見到GFP表達，且與原始細胞相比，轉(zhuǎn)染慢病毒載體的各組細胞細胞形態(tài)未見明顯變化，qPCR實驗證實相對于原始細胞，含有EphB4基因序列的慢病毒轉(zhuǎn)染的靶細胞中EphB4基因的表達量明顯升高。

綜上所述，本研究成功運用慢病毒為載體，將人工合成的EphB4基因序列轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細胞，并通過靶細胞抗生素篩選實驗，最終獲得了穩(wěn)定過表達EphB4基因的結(jié)腸癌細胞株，對于研究結(jié)腸癌的基因治療提供了有益的實驗依據(jù)。

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