劉 軍，王洪偉，陳 語，于海龍，王 琪，楊會峰，馬駿雄，項(xiàng)良碧 (沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110016)

原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)關(guān)節(jié)軟骨間充質(zhì)祖細(xì)胞(mesenchymal progenitor cells，MPCs)數(shù)量僅占關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量的3% ～4%，雖然OA關(guān)節(jié)軟骨的MPCs比正常人增殖活躍，但其成軟骨、成骨分化能力均降低。如何利用相關(guān)生長因子進(jìn)行刺激，調(diào)控原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖和成軟骨分化作用，恢復(fù)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)和維持軟骨組織的損傷與修復(fù)的動態(tài)平衡，具有重要的臨床應(yīng)用前景。bFGF和TGF-β均參與MPCs增殖的調(diào)控，生長因子對MPCs生物學(xué)行為的調(diào)控作用相當(dāng)復(fù)雜，體外使用多種生長因子復(fù)合作用于MSCs才可能盡量模擬體內(nèi)的生化環(huán)境，如何應(yīng)用多種生長因子，單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用生長因子等都有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究［1-3］。本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度、單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用bFGF和TGF-β1對OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs增殖作用的影響，為臨床治療軟骨退變和軟骨損傷提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨間充質(zhì)祖細(xì)胞通過免疫磁珠方法分選得到。生長因子相關(guān)試劑:TGF-β1(美國 R＆D system)、bFGF(美國 PeproTech公司)。

1.2 方法

將P2代OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs以每孔1×104的濃度接種于96孔板中，用含10%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液分別配制含bFGF或/和TGF-β1的培養(yǎng)液。每一濃度設(shè)5個復(fù)孔，對照組加入無上述生長因子的含10%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，隔日換液。生長因子促增殖培養(yǎng)第1～7天，每日進(jìn)行MTT檢測。生長因子按照下列分組加入:A 組按終濃度 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL 加入TGF-β1;B 組按終濃度 1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL 加入bFGF;C 組按終濃度(0.1+1.0)、(0.5+5.0)、(1.0+10.0)、(5.0+50.0)、(10.0+100.0)ng/mL 加入 TGF-β1+bFGF。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較如方差齊性采用兩樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如方差不齊，則采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，多組間比較采用多樣本方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P值均表示雙側(cè)概率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度bFGF對MPCs增殖的影響

結(jié)果顯示(圖1)，bFGF在10.0～50.0 ng/mL范圍內(nèi)單獨(dú)作用，均能夠促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖(P＜0.05)，而隨著bFGF濃度的增加其促增殖作用無明顯增加，各組之間比較，P ＞0.05。

2.2 不同濃度TGF-β1對MPCs增殖的影響

結(jié)果顯示(圖 2)，TGF-β1在0.1 ～1.0 ng/mL 范圍內(nèi)單獨(dú)作用，均能夠促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖(P＜0.05)，而隨著TGF-β1濃度的增加其促增殖作用無顯著增加，各組之間比較，P ＞0.05。

2.3 不同濃度bFGF+TGF-β1對MPCs增殖的影響

結(jié)果顯示(圖3)，不同濃度TGF-β1和bFGF聯(lián)合作用時，TGF-β11.0 ng/mL+bFGF 10.0 ng/mL 能夠促進(jìn) OA 關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖(P＜0.05)，而隨著 TGF-β1和 bFGF濃度增高或減低其增殖作用均無明顯增加(P＞0.05)。

3 討論

FGF、TGF-β等多種生長因子參與調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖作用［1-3］。bFGF是一種廣譜的有絲分裂和毛細(xì)血管增殖刺激劑，對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等有明顯的促增殖作用［4］。Scutt等［5］發(fā)現(xiàn)bFGF(5 ng/mL)可明顯促進(jìn)MSCs的增殖并且能增加傳代的次數(shù)。Solchaga等［6］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 1.0 ～ 10.0 ng/mL的bFGF與MSCs細(xì)胞克隆的數(shù)目呈正相關(guān)。TGF-β主要存在于骨及軟骨細(xì)胞內(nèi)，它具有對細(xì)胞增殖及分化的雙向調(diào)節(jié)功能，它一方面對中胚層的細(xì)胞具有加速分裂增生作用，另一方面又具有抑制細(xì)胞分化的作用［7］。Worster等［8］對 MSCs體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入TGF-β可以誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞，其Ⅱ型膠原的表達(dá)與TGF-β的劑量呈正相關(guān)，5～10 ng/mL的TGF-β可有效促進(jìn)MSCs增殖和分化。TGF-β濃度達(dá)到10 ng/mL可使Ⅱ型膠原、Aggercan等因子的表達(dá)量提高2倍以上。最近的研究結(jié)果指出，TGF-β3刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并且在兔體外軟骨急性損傷模型中進(jìn)行了驗(yàn)證［9］，TGF-β1在體外能夠刺激滑模和骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成［10］，并且更加令人振奮的研究結(jié)果是TGF-β1能夠增強(qiáng)兔軟骨缺損的修復(fù)［11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，bFGF在10.0～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，TGF-β1在 0.1 ～1.0 ng/mL 范圍內(nèi)單獨(dú)作用能顯著促進(jìn)OA關(guān)節(jié)軟骨MPCs細(xì)胞的增殖，而隨著濃度的增加其促增殖作用沒有明顯增加。bFGF和TGF-β1兩者聯(lián)合作用，在 bFGF 10.0 ng/mL 和 TGF-β11.0 ng/mL促增殖作用增加明顯，但隨著濃度增高其增殖作用無顯著提高，表明bFGF和TGF-β1作為促細(xì)胞增殖的生長因子，在適宜濃度對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。選擇生長因子的最佳濃度促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖和生長在臨床上具有重要作用。

隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)的發(fā)展及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，基因治療作為近年來興起的一種治療方法，可在分子水平進(jìn)行調(diào)控，從而為延緩或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程提供了可能。轉(zhuǎn)染細(xì)胞不僅可持續(xù)表達(dá)目的基因，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成，而且可作為“蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠”除影響自身的新陳代謝外，還影響周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、基質(zhì)的新陳代謝，從而促進(jìn)退變結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。一定濃度的 bFGF、TGF-β1及 bFGF+TGF-β1對原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖具有重要作用，而不同濃度的 bFGF、TGF-β1及 bFGF+TGF-β1對原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨MPCs的增殖作用不同。

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