侯天勇，許建中 (第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科，全軍矯形外科中心，重慶 400038)

抗感染治療是創(chuàng)傷所致的開(kāi)放性骨折、骨髓炎以及外科術(shù)后處理中必不可少的重要措施。常規(guī)抗感染治療主要通過(guò)口服或靜脈給藥，雖然可以取得一定療效，但對(duì)于嚴(yán)重骨組織感染的患者，感染骨組織周?chē)难髁繙p少，容易導(dǎo)致藥物在血液中濃度高而局部骨組織中濃度低的現(xiàn)象，降低了治療效果。目前，應(yīng)用生物相容性好、可降解的包裹材料制備成藥物緩釋載體并移植在骨折局部的給藥方法，實(shí)現(xiàn)了直接給藥、增強(qiáng)藥物療效的作用。為此，筆者對(duì)纖維蛋白包裹的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球(fibrin-gel-coated vancomycin alginate beads，F(xiàn)G-Vanco-AB)進(jìn)行制備和優(yōu)化，為其在骨組織抗感染治療中的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球的制備和優(yōu)化

將藻酸鹽(美國(guó)Sigma公司，低粘度細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))溶解于去離子水，制成4%、8%、12%、16%和20%的溶液，分別與等體積的10、20和50 mg/mL的萬(wàn)古霉素溶液混合。用注射器抽取后，加壓使混合溶液緩慢滴注到攪動(dòng)的1.01%(w/v)氯化鈣水溶液中。10 min后，將從氯化鈣水溶液中收集的藻酸鹽微球用去離子水洗凈，－70℃凍存6 h后再低壓凍干6～8 h，直至重量不再變化后分裝保存。稱(chēng)取相同質(zhì)量的由不同濃度藻酸鹽和萬(wàn)古霉素溶液制備的微球，用5 mL的5%(w/v)檸檬酸三鈉溶液裂解微球，收集裂解液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液在高效液相色譜儀上測(cè)定萬(wàn)古霉素濃度。萬(wàn)古霉素含量(%)=微球中萬(wàn)古霉素質(zhì)量/藻酸鹽微球的質(zhì)量×100%。

1.2 FG-Vanco-AB 的優(yōu)化

16%藻酸鹽溶液與50 mg/mL萬(wàn)古霉素的混合溶液制備的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球凍干后，每組分3份，分別置入0、30、60、75和90 mg/mL的纖維蛋白原的磷酸二氫鉀(0.05 mol/L)溶液中緩慢攪動(dòng)。10 min后浸入到400 IU/mL凝血酶中緩慢攪動(dòng)，促進(jìn)凝膠在微球表面形成一層膜，即FG-Vanco-AB，然后將其撈出，室溫風(fēng)干，稱(chēng)量包裹后的微球重量。增重比率(%)=(包裹后微球質(zhì)量－包裹前微球質(zhì)量)/包裹前微球質(zhì)量×100%。

1.3 FG-Vanco-AB的體外釋放

將上述不同濃度纖維蛋白包裹的微球15 mg放置在10 mL體積的DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)中，于37℃恒溫箱中每天更換液體，收集培養(yǎng)基，以10 000 r/min離心10 min，取上清液在高效液相色譜儀上測(cè)定萬(wàn)古霉素濃度。

1.4 毒性試驗(yàn)

抽取體質(zhì)量為25 kg雄性山羊(第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)髂骨骨髓10 mL，按照文獻(xiàn)［1］方法獲取山羊間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。取第3 代 MSCs，以 2 ×104/mL的密度接種到24孔板中，每孔加入已收集的經(jīng)不同濃度纖維蛋白包裹的微球緩釋液1 mL，以普通培養(yǎng)基作為對(duì)照，觀察MSCs的生長(zhǎng)情況。在培養(yǎng)后1、3、5和7 d，各組選取3孔，用PBS溶液洗3次，加入1 mL普通培養(yǎng)基，加入100 μl的CCK-8 kit(日本Dojindo Lab公司)液體，在37℃孵育2 h，然后取100 μl孵育液到96孔板，通過(guò)酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)得吸光度(A)值。相對(duì)存活系數(shù)(%)=(樣本的 A值/對(duì)照的 A值)×100%。

1.5 萬(wàn)古霉素的濃度與活性測(cè)定

分別將收集的樣本液進(jìn)行高效液相(Waters 510泵，484紫外檢測(cè)器)分析，測(cè)得其中萬(wàn)古霉素的含量。具體方法為:取上清液10～50 μl進(jìn)樣，流動(dòng)相為乙腈和KH2PO4溶液(0.05 mol/L)，8︰92 混合，磷酸調(diào) pH 值至 3.2，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm。通過(guò)試管稀釋法測(cè)定萬(wàn)古霉素對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)最小的抑菌濃度。萬(wàn)古霉素被用含有0.5 mL附加陽(yáng)離子的M-H肉湯連續(xù)倍加稀釋。每一組試管的葡萄球菌接種物是0.5 mL過(guò)夜的含有5.0×105/mL菌落單位的培養(yǎng)基。最小抑菌濃度是在37℃孵育24 h后能夠阻止菌液混濁的最低抗生素濃度。測(cè)定最小抑菌濃度后，取每一干凈試管中0.01 mL液體鋪在血液瓊脂平皿上。最小殺菌濃度是在37℃孵育24 h后，使平皿上菌落數(shù)目為10個(gè)或是以下的抗生素的最低濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 緩釋微球的性狀

萬(wàn)古霉素藻酸鹽溶液在氯化鈣溶液中可形成淺白色的球狀物，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，微球顏色逐漸加深，變成乳白色，球體的硬度增加。球體的大小主要取決于滴注的藻酸鹽液滴的大小。本研究中藻酸鹽微球的大小在5 mm左右，凍干后藻酸鹽微球的體積明顯減小，縮減至大約3 mm。被纖維蛋白凝膠包裹后的藻酸鹽萬(wàn)古霉素微球體積無(wú)明顯變化，經(jīng)0、30、60、75和90 mg/mL纖維蛋白溶液浸泡，再經(jīng)凝血酶塑形而形成通透膜包裹的微球的增重比率分別為(－0.27±3.65)%、(3.53±2.03)%、(6.17 ±2.22)%、(8.34 ±2.09)%、(8.79 ±2.00)%，表面變得更光滑。

2.2 藻酸鹽微球中萬(wàn)古霉素的含量

在混合液中萬(wàn)古霉素濃度相同的條件下，隨著藻酸鹽溶液濃度的升高，最后成形的微球中萬(wàn)古霉素的含量逐漸增加。起始藻酸鹽溶液達(dá)到16%時(shí)所制備的微球中萬(wàn)古霉素的含量最高，至20%時(shí)開(kāi)始減低。在藻酸鹽濃度相同的條件下，微球中萬(wàn)古霉素的含量隨著制備混合液中萬(wàn)古霉素濃度的增加而顯著增加(圖1)。由50 mg/mL萬(wàn)古霉素和16%藻酸鹽的混合液制備的微球，萬(wàn)古霉素的含量最高，達(dá)(27.36±0.90)%。

圖1 不同濃度的萬(wàn)古霉素和藻酸鹽溶液混合后制備的微球中萬(wàn)古霉素的含量

2.3 FG-Vanco-AB釋放的萬(wàn)古霉素

萬(wàn)古霉素對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 25923)的最小抑菌濃度和殺菌濃度分別為1.20 mg/L和2.10 mg/L，藥物敏感的折點(diǎn)值為5 mg/L。以萬(wàn)古霉素敏感的折點(diǎn)值作為最低濃度標(biāo)準(zhǔn)，放置未包裹的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球的溶液中萬(wàn)古霉素的濃度超過(guò)此值的連續(xù)時(shí)間為11 d，而由30、60、75和90 mg/mL纖維蛋白溶液形成包裹的FG-Vanco-AB溶液中，釋放的萬(wàn)古霉素的濃度超過(guò)5 mg/L的時(shí)間分別為13、17、19和19 d(圖2)。

圖2 不同濃度纖維蛋白凝膠包裹的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球在體外釋放的萬(wàn)古霉素的濃度。圖中橫線表示對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25923)具有敏感殺滅作用的折點(diǎn)值的萬(wàn)古霉素的濃度(5 mg/L)

2.4 毒性試驗(yàn)

MSCs在各實(shí)驗(yàn)組中均表現(xiàn)較明顯的增殖趨勢(shì)，細(xì)胞形態(tài)正常。各組相對(duì)生存率在培養(yǎng)后1 d均有不同程度的降低，3 d降低較明顯，5 d至最低(各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);培養(yǎng)后7 d各組的相對(duì)生存率均出現(xiàn)不同程度的升高(圖3)。

圖3 不同濃度纖維蛋白凝膠包裹的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球?qū)才囵B(yǎng)的MSCs增殖的影響

3 討論

藻酸鹽是天然的可吸收材料，屬于多糖類(lèi)物質(zhì)，主要從褐藻中提取，其主要成分為β-D-甘露糖醛酸(M殘基)和α-L-古洛糖醛酸(G殘基)，具有優(yōu)良的生物相容性和可降解特性，在鈣離子溶液中即可形成熱穩(wěn)定凝膠，不需要高溫或有機(jī)化學(xué)試劑交聯(lián)，有利于其作為可溶性緩釋藥物的包裹材料［2-3］。目前，利用藻酸鹽優(yōu)良的生物學(xué)特性制備的局部抗生素控釋微球已經(jīng)被用于慢性骨髓炎的治療研究，取得了較好的治療效果［4］。但是，單純的萬(wàn)古霉素藻酸鹽緩釋微球釋放的藥物達(dá)到有效治療濃度的持續(xù)時(shí)間還不足夠長(zhǎng)［5］，已有左旋多聚賴(lài)氨酸被用于包裹藻酸鹽抗生素微球，其藥物有效釋放時(shí)間得到延長(zhǎng)［3］。筆者設(shè)計(jì)了FG-Vanco-AB緩釋系統(tǒng)，對(duì)相應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，萬(wàn)古霉素的有效釋放時(shí)間較前有所延長(zhǎng)。

大量的抗生素可供臨床和實(shí)驗(yàn)研究使用，但是，針對(duì)目前骨組織感染的救治現(xiàn)狀，大量的耐藥菌株的出現(xiàn)以及藻酸鹽的包裹特性，萬(wàn)古霉素是最佳的選擇對(duì)象。萬(wàn)古霉素是一種糖肽類(lèi)抗生素，對(duì)引起骨感染常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的殺滅能力，其中包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄菌(包括耐甲氧西林菌株)，以及鏈球菌(包括化膿性鏈球菌)等［6-7］。同時(shí)，萬(wàn)古霉素易溶于水，可同藻酸鹽制成混合溶液，通過(guò)滴注形成緩釋微球。萬(wàn)古霉素?zé)o明顯的毒副作用，不像青霉素類(lèi)會(huì)引起強(qiáng)烈的變態(tài)反應(yīng)。

用于局部埋置的藥物緩釋包裹材料的選擇應(yīng)當(dāng)具有以下特點(diǎn):生物相容性好，降解成分可被人體吸收;載藥量高，可以滿足局部用藥的需要;所包裹的藥物釋放平緩，具有較低的突釋率，避免瞬間形成可引起副作用的高藥物濃度。藻酸鹽具有良好的生物相容性和可降解特性，已被廣泛用作細(xì)胞載體和藥物緩釋載體［8-9］。而異體和(或)異種纖維蛋白凝膠也因?yàn)槠淞己玫纳锵嗳菪院宛じ教匦栽谂R床中得以使用。如果使用患者自身的血漿制備凝膠，則可以完全避免潛在的誘導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。

在本研究中，通過(guò)調(diào)整制備微球的藻酸鹽和萬(wàn)古霉素的起始濃度，優(yōu)化篩選萬(wàn)古霉素含量最高的緩釋微球，提高單位質(zhì)量微球的載藥量，可以減少局部用藥時(shí)緩釋載體的放置量，避免過(guò)多的外源性物質(zhì)對(duì)局部組織成骨可能造成的影響。同時(shí)，通過(guò)低壓凍干和表面包裹纖維蛋白凝膠，使微球的儲(chǔ)存更為方便，并延長(zhǎng)了萬(wàn)古霉素的釋放時(shí)間［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，用于包裹藻酸鹽微球的纖維蛋白凝膠的兩種成分纖維蛋白原和凝血酶的濃度越高，微球中萬(wàn)古霉素的突釋越少，其釋放時(shí)間越長(zhǎng)，這同 Jeon等［11］的研究相一致。具體原因在于形成纖維蛋白凝膠的主體是纖維蛋白原，凝血酶只是促進(jìn)纖維蛋白原3條鏈當(dāng)中的2條鏈αA和βB斷裂，釋放多肽A和B，使其轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體，相互間自發(fā)聚集形成多聚體;同時(shí)凝血酶激活ⅩⅢ因子，激活的ⅩⅢ因子在Ca2+的作用下催化各纖維蛋白單體間的第三條鏈γ的谷氨酰胺殘基和賴(lài)氨酸的ε-氨基形成共價(jià)鍵，最終形成網(wǎng)狀的纖維蛋白多聚體［12］。纖維蛋白凝膠的包裹就像一層膜，纖維蛋白原的濃度越高，形成的膜越致密，孔徑越小，限制了水分進(jìn)入到藻酸鹽微球，因而減少了萬(wàn)古霉素的洗脫。同時(shí)，高濃度成分形成的包裹外膜強(qiáng)度也高，限制了微球吸水后的膨脹，因而減慢了微球的崩解，延長(zhǎng)了藥物釋放時(shí)間。凝血酶的濃度選定為400 IU/mL，而并未進(jìn)行濃度優(yōu)化，主要是基于以下考慮:形成的纖維凝膠蛋白膜的致密程度和強(qiáng)度主要是由纖維蛋白原的濃度決定的，凝血酶只是觸發(fā)反應(yīng)的酶;高濃度的凝血酶(如400 IU/mL)才可以保證在短時(shí)間內(nèi)微球表面形成均勻一致的膜;縮短酶促反應(yīng)時(shí)間，減少微球在溶液中浸泡的時(shí)間，避免微球中包含的藥量因?yàn)榻荻鴣G失。

藥物緩釋載體的安全性以及是否能夠滿足治療需要也是本研究觀察的重點(diǎn)。通過(guò)將不同方式處理的微球同MSCs共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)和活力的變化來(lái)評(píng)價(jià)其安全性，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)良好，活力輕度受抑制，體現(xiàn)了較好的安全性。對(duì)于緩釋微球療效的評(píng)價(jià)，主要是定時(shí)收集微球緩釋的溶液并以高效液相色譜儀測(cè)定其中萬(wàn)古霉素濃度，以標(biāo)準(zhǔn)的ATCC 25923金黃色葡萄球菌株作為參照，通過(guò)測(cè)定萬(wàn)古霉素對(duì)其具有敏感殺滅作用的折點(diǎn)值，觀察微球釋放的萬(wàn)古霉素濃度可以滿足殺滅金黃色葡萄球菌的時(shí)間長(zhǎng)短。研究顯示，有效的釋放天數(shù)最長(zhǎng)可達(dá)19 d，較其他包裹方式有所延長(zhǎng)［3］。同時(shí)，高效液相色譜儀的應(yīng)用，一方面可以提高溶液中萬(wàn)古霉素濃度檢測(cè)的靈敏度，另一方面，根據(jù)待測(cè)物質(zhì)出現(xiàn)峰形的時(shí)間，還可以判斷是否為萬(wàn)古霉素而非其他物質(zhì)。

總之，通過(guò)優(yōu)化萬(wàn)古霉素和藻酸鹽混合溶液的不同比例，篩選高含量的萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球。再通過(guò)調(diào)整包裹萬(wàn)古霉素藻酸鹽微球的纖維蛋白凝膠的構(gòu)成成分纖維蛋白原的濃度，篩選萬(wàn)古霉素緩釋時(shí)間長(zhǎng)的微球，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的毒性和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的活性。結(jié)果顯示FG-Vanco-AB釋放的萬(wàn)古霉素濃度體外達(dá)到可殺滅標(biāo)準(zhǔn)菌株的時(shí)間為19 d，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖影響微弱，提示其在骨科抗感染治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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