吳永濤，冷少華，劉宏亮，姚忠祥 (第三軍醫(yī)大學(xué):.西南醫(yī)院康復(fù)科;.基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室，重慶 400038)

大麻素類(lèi)物質(zhì)主要有從天然植物中提取的大麻、人工合成的大麻和內(nèi)源性大麻。目前公認(rèn)的大麻素受體有CB1、CB2兩種，均為G蛋白偶聯(lián)受體［1］。隨著大麻素的作用被逐漸發(fā)現(xiàn)和認(rèn)可，其受體的分布情況也得到更多的研究［2］，但其在不同部位陽(yáng)性細(xì)胞的具體類(lèi)型、數(shù)量、及兩種受體的共表達(dá)情況沒(méi)有做具體的研究，特別對(duì)CB2受體的研究較少。既往研究表明，CB1受體主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，近期研究發(fā)現(xiàn)，CB2受體在神經(jīng)組織中也有較廣泛的分布，大腦、小腦、腦干等多部位均有分布，且多種類(lèi)型的細(xì)胞均表達(dá)該兩種受體［3］，但具體細(xì)胞類(lèi)型研究不夠充分。CB2受體在神經(jīng)組織中的這種表達(dá)與前人大量研究的CB1受體有著密切聯(lián)系，提示CB2受體同樣參與神經(jīng)系統(tǒng)的重要功能［4］。大麻素受體的分布研究主要通過(guò)放射自顯影、原位雜交、PET［5-6］、免疫組織化學(xué)［7］等方法，每一種方法均有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺陷。本文主要運(yùn)用熒光雙標(biāo)的方法研究大麻素受體陽(yáng)性細(xì)胞的類(lèi)型，為解決上述問(wèn)題提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及標(biāo)本

成年Spraque-Dawley大鼠(雌雄不限)10只，體質(zhì)量220～250 g。1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，生理鹽水灌注15 min后，4%多聚甲醛固定20 min，1 mL/g。低溫下取出腦組織，后固定12 h。30%蔗糖溶液脫水過(guò)夜。OCT包埋，恒冷冰凍切片機(jī)切片(10 μm)。

1.2 抗體及試劑

CB1、CB2抗體(sigma)、少突膠質(zhì)細(xì)胞抗體CC-1、神經(jīng)元抗體 anti-βⅢ tubulin，GFAP 抗體，熒光二抗:Cy3、FITC，DAPI(sigma)，多聚甲醛(重慶化學(xué)試劑廠)、甘油(北京紅星化工廠)、戊巴比妥鈉(上海試劑一廠)。

1.3 免疫熒光組織化學(xué)

分別以抗CB1、CB2抗體為一抗，選擇特異性的熒光二抗，行免疫熒光化學(xué)染色，然后再次選取抗神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞抗體為一抗，特異性熒光二抗，重復(fù)前述步驟，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色。具體雙標(biāo)情況如下(CB2受體雙標(biāo)組合原理同上)。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 一抗:抗CB1/CB2抗體，兔來(lái)源。二抗:cy3，山羊抗兔，紅色熒光。一抗:Anti-βⅢ Tubulin/cc-1/GFAP，小鼠來(lái)源。二抗:FITC，兔抗小鼠，綠色熒光。

1.3.2 熒光雙標(biāo)操作 貼片經(jīng)0.01M PBS漂洗5 min×3次;滴加正常封閉用血清(1%BSA/0.4%TritonX-100)室溫下孵育30 min;用濾紙吸去多余血清，滴加一抗，37℃ 2 h，后入4℃冰箱過(guò)夜;0.01M PBS漂洗5 min×3次;滴加二抗，37℃孵育2 h;0.01M PBS漂洗5 min×3次;滴加一抗，37℃ 2 h，后入4℃冰箱過(guò)夜;0.01M PBS漂洗5 min×3次;滴加二抗，37℃孵育2 h;0.01M PBS漂洗5 min×3次;吸掉多余 PBS液，滴加0.1‰DAPI染核;中性樹(shù)膠封片;olympus顯微鏡觀察，數(shù)碼相機(jī)照相。

2 結(jié)果

大麻素受體在腦組織中分布的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型主要有神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞，不同的腦區(qū)及細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)二種受體存在差異。神經(jīng)元中的表達(dá)情況(圖1):大麻素CB1、CB2受體在大腦皮層、海馬、基底神經(jīng)節(jié)區(qū)、嗅球、腦橋的神經(jīng)細(xì)胞以及小腦的浦肯野細(xì)胞層均有表達(dá)。在大腦皮層，表現(xiàn)為中等量的表達(dá)，著色部位多位于核周和胞體，突起上也有著色。在海馬，2種大麻素受體都有很強(qiáng)的表達(dá)，核周和胞體及突起上可見(jiàn)陽(yáng)性著色，CA1和CA3表達(dá)最強(qiáng)，二者無(wú)明顯差別。在基底神經(jīng)節(jié)區(qū)，二者的表達(dá)量及染色部位類(lèi)似于其在大腦皮層的分布情況，CB2的表達(dá)量略高。在嗅球，有較強(qiáng)表達(dá)，僧帽細(xì)胞層、小球?qū)蛹靶崆騼?nèi)層白質(zhì)均可見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞，二者表達(dá)量及染色部位差別不明顯，多為胞體著色。在腦橋，表達(dá)很高，著色部位多位于核周和整個(gè)胞體，表達(dá)量上二者差別不明顯。在小腦浦肯野細(xì)胞層，有很高的表達(dá)，表達(dá)量無(wú)明顯差異，陽(yáng)性部位多位于核周和突起上，少數(shù)細(xì)胞整個(gè)胞體著色。在胼胝體區(qū)也有二者的表達(dá)，特別是CB2受體的表達(dá)較明顯，多位于核周和突起上。

少突膠質(zhì)及星型膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況(圖2):腦白質(zhì)區(qū)是膠質(zhì)細(xì)胞分布最集中的區(qū)域，同時(shí)也是我們研究膠質(zhì)細(xì)胞分布的重點(diǎn)區(qū)域，根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞中明確存在該2種受體的表達(dá)。比較2種膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于星型膠質(zhì)細(xì)胞，且陽(yáng)性染色部位存在較大差異。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)2種大麻素受體CB1、CB2的分布

圖2 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)兩種大麻素受體CB1、CB2的分布

3 討論

大麻素受體CB1和CB2在成年大鼠腦組織中的分布很廣泛，并且二者的分布有很大的相似性。如大腦皮層、海馬、基底神經(jīng)節(jié)區(qū)以及小腦等部位共同表達(dá)這2種受體。在腦組織中，CB1受體主要分布于神經(jīng)元來(lái)發(fā)揮其作用，而CB2受體在體內(nèi)對(duì)神經(jīng)元的功能研究尚不明確［8］。因此我們通過(guò)2種抗體熒光雙標(biāo)法，觀察和驗(yàn)證在不同腦區(qū)的神經(jīng)元上的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)大鼠腦中的多數(shù)部位，如嗅腦、大腦、小腦及腦干中均有神經(jīng)元表達(dá)此2種受體，二者在神經(jīng)元中的分布情況大致相同。已知分布于神經(jīng)元突觸前膜的CB1受體可以調(diào)節(jié)遞質(zhì)的釋放［9］，提示CB2受體很有可能也參與了該過(guò)程。CB2受體可能同樣參與了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及信號(hào)傳遞［10］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CB2受體在腦橋和延髓的陽(yáng)性細(xì)胞突起上的分布最為明顯，表明CB2受體在該區(qū)域的遞質(zhì)釋放方面也可能發(fā)揮重要的作用。這種分布對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)是否密切聯(lián)系尚待證實(shí)。而二者分布上的相似性更進(jìn)一步說(shuō)明2種大麻素受體存在相互協(xié)同或抑制作用。如小腦的浦肯野細(xì)胞及海馬的錐體細(xì)胞是2種大麻素受體雙標(biāo)比較明顯的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，這更有可能提示2種大麻素受體在運(yùn)動(dòng)及記憶認(rèn)知方面共同有著重要的作用［11］。

大麻素受體CB1具有促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞存活及分化的功能，CB2受體可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及大麻素受體具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)等作用［12］。尤其在少突膠質(zhì)細(xì)胞，大麻素激活其受體不僅能抑制炎癥反應(yīng)從而起到保護(hù)作用，同時(shí)在促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞存活、增殖甚至分化等方面發(fā)揮了很重要的作用［13］。大麻素受體在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)同樣也提示，在炎性脫髓鞘性疾病中，大麻素激活其受體作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，起到抗炎和神經(jīng)保護(hù)的作用。

2種大麻素受體在成年大鼠腦內(nèi)有廣泛的表達(dá)，在不同腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞均有表達(dá)，且表達(dá)于多種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，說(shuō)明二者存在于神經(jīng)系統(tǒng)的多種類(lèi)型的細(xì)胞中，提示位于細(xì)胞不同位置的大麻素受體發(fā)揮的作用可能不同。研究它們分布細(xì)胞類(lèi)型上的差別及分布部位上區(qū)別，為更好地研究2種大麻素受體在神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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