李曉聲，陳鐵柱*，曾焱

(1.湖南省人民醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410005；2.湖南旺旺醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410016)

實驗研究

腰椎間盤退變模型的設(shè)計

李曉聲1，陳鐵柱1*，曾焱2

(1.湖南省人民醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410005；2.湖南旺旺醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410016)

目的建立一種兔腰椎間盤突出癥的動物模型。方法動物隨機(jī)分為實驗組、對照組，每組10只，實驗組將0.2 mL無菌0.9%氯化鈉溶液緩慢注入L4～5椎間盤內(nèi)。對照組椎間盤不穿刺注入，分別于造模后第2、4、8周進(jìn)行X線檢查后處死，從解剖形態(tài)、X線片、組織學(xué)觀察椎間盤退變。結(jié)果該方法能使椎間盤質(zhì)地變硬、椎間盤周緣骨贅形成、椎間隙變窄、纖維環(huán)纖維排列散亂、髓核消失，2～8周觀察：解剖形態(tài)：被注射椎間盤質(zhì)地逐漸變硬，椎間盤突向椎管內(nèi)壓迫硬脊膜，脊神經(jīng)根有黏連，分離困難。椎間盤周緣可見局部骨贅形成，質(zhì)硬；X線片：腰椎間隙逐漸變窄，骨贅形成，椎間孔狹??；組織學(xué)：纖維環(huán)逐漸變薄，部分區(qū)域纖維層排列散亂，髓核消失，被增生的類骨質(zhì)、骨質(zhì)取代。結(jié)論選用家兔在直視下行椎間盤內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液的方法，可成功制備腰椎間盤退變模型。

椎間盤退變；動物模型；0.9%氯化鈉溶液；兔

腰椎間盤突出癥是引起腰背疼痛的主要原因，臨床發(fā)病率高，近年來該病呈年輕化趨勢發(fā)展，嚴(yán)重影響人們的生活及工作。該病發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，相關(guān)研究表明椎間盤退變是其主要原因[1]。為了研究椎間盤退變的機(jī)理以及為臨床治療椎間盤突出提供試驗指導(dǎo)，學(xué)者們建立了大量動物模型，其中以針刺法最常用。本實驗將針刺法進(jìn)行改良，以7號腰穿針穿刺兔椎間盤，并注射0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液制備兔腰椎間盤退變模型。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 同種、體健家兔20只，年齡0.5～1.0 歲，體重2.5～3.0 kg。由長沙市東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院臨床研究所清潔級動物實驗室。實驗前分籠喂養(yǎng)2周，以觀察健康狀況。動物房實行7：00～19：00光暗交替，相對濕度40%～70%，溫度18～29℃。

1.2 實驗方法 受趙定麟方法[2]啟示，動物隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組10只，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定，左下腹部剃毛清洗后，常規(guī)消毒鋪無菌孔巾。取左下腹縱切口，長約7 cm，經(jīng)腹膜外達(dá)腰椎前筋膜。鈍性剝離顯露L4S1前方椎體及椎間盤。確定L4～5椎間盤后，實驗組取7號腰穿針將0.2 mL無菌0.9%氯化鈉溶液緩慢注入椎間盤內(nèi)，深度為0.5 cm，相當(dāng)于髓核部位。對照組不予以椎間盤穿刺注水，其余步驟同前。逐層縫合傷口，術(shù)后分籠自由活動。術(shù)后3 d給予青霉素肌注，8萬U/d。

1.3 解剖觀察 分別于造模手術(shù)后第2、4、8周末，耳緣靜脈注射空氣10 mL，各組隨機(jī)處死3只解剖觀察。每組10只，剩余1只替補(bǔ)兩組試驗動物意外死亡。如兩組均無死亡，第8周處理4只試驗動物。

1.4 X線片檢查 分別于造模后第2、4、8周，各組隨機(jī)選出3只予以拍攝腰椎X線片。1.5 組織形態(tài)學(xué)檢查 造模手術(shù)后各組第2、4、8周，耳緣靜脈注射空氣10 mL，各周隨機(jī)處死3只，取其L4～5椎間盤，行石蠟切片及HE染色后，光鏡下觀察各時期椎間盤組織形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 解剖學(xué)觀察結(jié)果 對照組：該組各時期椎間盤周緣與毗鄰組織無黏連，椎管內(nèi)無滲血，椎間盤觸之質(zhì)韌。實驗組：術(shù)后2周：被注射椎間盤周緣與毗鄰組織有黏連，椎間盤觸之稍質(zhì)硬；術(shù)后4周：被注射椎間盤周緣與毗鄰組織黏連緊密，不易分離，椎間盤硬度增加(見圖1)；術(shù)后8周：被注射椎間盤成骨樣硬(7號腰穿針難以刺入)，椎間盤突向椎管內(nèi)壓迫硬脊膜，脊神經(jīng)根有黏連，分離困難。椎間盤周緣可見局部骨贅形成，質(zhì)硬(見圖2)。

圖1 實驗組術(shù)后第4周肉眼觀察，被注射椎間盤周緣與 毗鄰組織黏連緊密，不易分離，椎間盤硬度增加

2.2 X線片實驗結(jié)果

2.2.1 對照組 各期拍片示腰椎間隙正常，椎體邊緣無骨贅形成，椎體骨質(zhì)密度無明顯改變。

圖2 實驗組術(shù)后第8周肉眼觀察，被注射椎間盤成骨樣硬，間盤突向椎管內(nèi)壓迫硬脊膜，脊神經(jīng)根有黏連，分離困難。椎間盤周緣課件局部骨贅形成，質(zhì)硬

2.2.2 實驗組 術(shù)后2周：注射后的腰椎間隙尚正常，椎體邊緣椎間隙部位可見局部密度增高影，椎間孔尚無明顯狹窄；術(shù)后4周：注射后的腰椎間隙可見變窄，椎體邊緣椎間隙部位骨贅形成，椎間孔可見狹窄改變；術(shù)后8周：注射后的腰椎間隙明顯變窄，甚至消失。椎間盤毗鄰椎體邊緣骨質(zhì)密度增高，骨贅形成，椎間孔狹小。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

2.3.1 對照組 對照組第2、4、8周末，每周隨機(jī)處死3只，取其L4～5椎間盤，各時期椎間盤組織學(xué)無明顯變化。椎間盤由外周的纖維環(huán)及中央的髓核組成。纖維環(huán)的外1/3主要是纖維組織，其間含有成纖維樣細(xì)胞，并與椎體的軟骨層相連，其間可見有少量的骨小梁；內(nèi)2/3則為纖維軟骨。椎間盤的纖維排列與人體結(jié)構(gòu)大致相似(見圖3)。

2.3.2 實驗組 術(shù)后2周：椎間盤形態(tài)規(guī)則，纖維層寬厚，排列規(guī)整，髓核明顯，椎間盤后緣已開始出現(xiàn)透明軟骨的類骨質(zhì)。術(shù)后4周：總體變化與前者相似，明顯變化是可見纖維組織壞死，被增生的骨質(zhì)取代(見圖4)。術(shù)后8周：椎間盤病理改變明顯，纖維環(huán)僅存于椎間盤邊緣，很薄，部分區(qū)域纖維層排列散亂，趨向于退變、壞死，髓核消失，被增生的類骨質(zhì)、骨質(zhì)取代。有大片透明軟骨和幾個骨質(zhì)增生區(qū)。增生的骨質(zhì)區(qū)域已形成骨髓腔，內(nèi)有骨髓組織(見圖5)。

圖3 對照組光鏡下顯示椎間盤形態(tài)規(guī) 圖4 試驗組術(shù)后4周，可見纖維組織 圖5 試驗組術(shù)后8周髓核消失，被增生

則,纖維環(huán)排列規(guī)整,髓核明顯(×40) 壞死，被增生的骨質(zhì)取代(×40) 的類骨質(zhì)、骨質(zhì)取代(×40)

3 討 論

3.1 實驗動物選擇 腰椎間盤退變是引起腰腿痛的一個主要因素。構(gòu)建腰椎間盤退變模型是研究椎間盤退變的病因和病理生理的基礎(chǔ)。良好的椎間盤退變模型需要符合椎間盤退變的規(guī)律，所選動物解剖和生理特點盡可能與人類接近，模型重復(fù)性好。靈長類解剖生理與人類最為相近，是動物模型最理想的選擇，但由于經(jīng)濟(jì)等原因受到限制，Elliott等[3]發(fā)現(xiàn)四肢動物椎間盤特性與人類相似，椎體長軸受力，認(rèn)為四肢動物可用于椎間盤退變模型的制備。目前多選用鼠、兔、犬、羊等動物。本實驗選用兔為模型動物主要考慮兔椎間盤大小合適，采用針刺法易于制作模型，其髓核和纖維細(xì)胞形態(tài)改變同人類變化相似，但其退變程度不如人類明顯。雖然兩者存在物種上的差異，但可作為研究椎間盤退變的實驗?zāi)Ｐ汀８鶕?jù)本實驗觀察，造模后實驗兔的腰椎間盤病理性退變與人類相似，基本符合椎間盤退變的模型要求。

3.2 實驗方法選擇 目前建立腰椎間盤退變動物模型主要通過物理、生化的方式改變脊椎生物力學(xué)結(jié)構(gòu)或椎間盤及髓核組織化學(xué)構(gòu)成，促使椎間盤出現(xiàn)自發(fā)退變，包括改變脊柱負(fù)荷或活動、損傷纖維環(huán)、破壞脊柱穩(wěn)定性、酶類/非酶類化學(xué)模型以及自發(fā)性退變模型，其中以針刺法損傷纖維環(huán)最常用[4-6]，該法微創(chuàng)、操作簡便、經(jīng)濟(jì)、見效迅速。本實驗采用針刺法，為確保針刺損傷纖維環(huán)，定位準(zhǔn)確，予以經(jīng)腹膜后直視下經(jīng)棘旁穿刺造模。本次實驗較順利，經(jīng)解剖觀察、X線片、組織切片觀察，說明椎間盤退變符合實驗造模要求。

3.3 實驗造模的機(jī)理 椎間盤退變的原因眾多，研究認(rèn)為椎間盤退變主要與椎間盤生物力學(xué)改變、生活習(xí)慣、職業(yè)、外傷、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、營養(yǎng)代謝障礙、細(xì)胞凋亡、缺血缺氧等相關(guān)因素有關(guān)。腰椎間盤退變的發(fā)生與發(fā)展是人體在生長發(fā)育停止后開始，多于23 歲后開始，纖維環(huán)與髓核相繼退變，髓核表現(xiàn)為脫水及吸水功能減退，以致體積減小，彈性降低。在椎間盤內(nèi)壓力改變時致使壓力分布不均，導(dǎo)致軟骨終板變形損傷，影響椎間盤營養(yǎng)改變，椎間盤組織細(xì)胞成分改變等加速椎間盤退變。本實驗造模用注射的方法既可增加局部間隙壓力，又能避免對機(jī)體不必要的影響，減少椎間盤退變其他因素影響。

腰椎X線片顯示椎間隙變窄主要是因為椎間盤內(nèi)容脫出及退行性變所致；在病變鄰近的椎間盤纖維環(huán)呈線狀鈣化，可為確診椎間盤纖維環(huán)破裂的直接X線象。手術(shù)造模2個月后的兔腰椎X線片顯示椎間隙變窄，骨贅形成，椎間隙內(nèi)線狀鈣化等征象，可基本判定注射后的椎間盤退變，纖維環(huán)破壞以及骨化與人的腰椎間盤退變X線片征象具有一致性。肉眼觀察到椎間盤與毗鄰組織黏連，向椎管內(nèi)突出并與神經(jīng)根有黏連等，符合腰椎間盤退變的病理過程。鏡下觀察從術(shù)后2周至8周的椎間盤組織切片，大體反映了注射0.9%氯化鈉溶液后椎間盤退變的基本過程。此退變過程結(jié)合肉眼觀察和X線征象，表明本實驗建立的腰椎間盤退變模型具備形態(tài)學(xué)改變基礎(chǔ)，模型是可靠的。

綜上所述，選用家兔在直視下行椎間盤內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液的方法，經(jīng)解剖觀察、X線片、組織切片觀察，椎間盤退變符合實驗造模要求。能再現(xiàn)椎間盤退行性變的客觀規(guī)律，動物模型制作相對簡便，從而模型重復(fù)性好；所選動物——兔作為常見的實驗動物，椎間盤結(jié)構(gòu)與人類基本相同，具有經(jīng)濟(jì)性和便利性等優(yōu)點，為研究腰椎間盤退變提供了一種合適的動物模型。

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ModelofLumbarIntervertebralDiscsDegeneration

LI Xiao-sheng1，CHEN Tie-zhu1，ZENG Yan2

(1.Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Hunan Province，Changsha 410005，China；2.Department of Drthopaedics，Wang Wang Hospital，Changsha 410016，China)

ObjectiveTo establish a model of rabbit lumbar disc herniation.MethodsIn the experimental group，0.2 mL 0.9% saline were slowly injected into L4～5intervertebral disc.We observe lumbar disc degeneration from anatomic form，X-ray，Histology.ResultsThis method stiffened the lumbar disc texture，induced osteophyte periphery to the discs，narrowed the lumbar disc space，dispersed the annulus fibers and made nucleus pulposus vanished.Observation after 2 to 8 weeks：Anatomic exam showed the injected lumbar disc texture gradually stiffened，the lumbar disc protruded into the spinal canal，and the spinal nerve roots bonded，difficult to be separated.There was osteophyte formed around the periphery of the disc.X-ray showed that the lumbar gap gradually narrowed，formed the osteophyte，and the foramen waned.Histology showed the annulus gradually became thinner，and part of the regional fiber layers arranged scattered，the Nucleus vanish and have been taken place by osteoid tissue and bone.ConclusionThe lumbar disc degeneration model can be established by 0.9% injecting saline into lumbar disc of rabbit.

intervertebral discs cataplasia；animal model；0.9% saline；rabbit

1008-5572(2014)05-0427-03

湖南省自然基金資助項目(06JJ4109)；湖南省科技廳科技計劃資助項目(2009SK3080)；*本文通訊作者：陳鐵柱

R681.5+3

：A

2013-12-16

李曉聲(1957- )，男，主任醫(yī)師，湖南省人民醫(yī)院，410005。