荊 譞， 張利芬， 王雄雅， 白素芬， 李 欣

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素的理化特性研究

荊 譞， 張利芬， 王雄雅， 白素芬， 李 欣

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 河南 鄭州 450002)

為了明確煙夜蛾Helicoverpaassulta幼蟲(chóng)血淋巴凝集素的理化性質(zhì)，采用糖抑制試驗(yàn)和血凝法檢測(cè)，分別測(cè)定了凝集素與不同糖類的結(jié)合特性和不同因素對(duì)其凝集活性的影響.糖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，在選用13種糖類中，不同糖類對(duì)凝集素凝集活性的抑制作用不同，其中乳糖、D-半乳糖和L-鼠李糖具有完全抑制作用，說(shuō)明煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素與這3種糖類有專一結(jié)合特性.血凝法檢測(cè)結(jié)果表明，不同因素對(duì)凝集活性的影響不同，其中煙夜蛾血淋巴凝集素凝集活性依賴于Ca2+，屬C型凝集素；反復(fù)凍融對(duì)凝集素的活性沒(méi)有影響；但隨處理溫度的升高或持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其凝集活性下降，在60 ℃處理15 min后凝集活性完全喪失；凝集素在pH 7.17時(shí)活性最高；凝集素對(duì)經(jīng)胰蛋白酶修飾后的鴨血紅細(xì)胞的凝集活性明顯增強(qiáng)；血淋巴中酚氧化酶引起的黑化未對(duì)其凝集活性產(chǎn)生影響，說(shuō)明同為體液免疫因子的凝集素與酶氧化酶在昆蟲(chóng)免疫防御中的協(xié)同性.

凝集素；理化特性；煙夜蛾

細(xì)胞免疫和體液免疫是昆蟲(chóng)擁有的高效免疫防御系統(tǒng)，用以防止微生物或寄生物的入侵.而作為非特異性體液免疫因子的凝集素，是進(jìn)行“異己”識(shí)別，實(shí)施免疫監(jiān)視，啟動(dòng)防御機(jī)能，防止異物入侵的首道屏障，在調(diào)節(jié)細(xì)胞與體液免疫及酚氧化酶原激活中發(fā)揮重要作用[1].已有研究表明，昆蟲(chóng)凝集素是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，具有一個(gè)或多個(gè)可以與單糖或寡糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域，其生物活性主要通過(guò)對(duì)糖的專一性識(shí)別表現(xiàn)出來(lái)，但不同昆蟲(chóng)凝集素專一性結(jié)合的糖類不同，生物活性也有差別[2]，如黏蟲(chóng)Mythimnaseparata幼蟲(chóng)血淋巴凝集素專一性結(jié)合的糖基及其衍生物為乳糖、巖藻糖和神經(jīng)氨酸，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis均為半乳糖，而家蠶Bombyxmori卻不與乳糖或半乳糖結(jié)合[3;4].煙夜蛾Helicoverpaassulta是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，研究發(fā)現(xiàn)，其蛹凝集素與近緣種棉鈴蟲(chóng)蛹的糖結(jié)合特性也不完全相同，且在個(gè)體發(fā)育的不同階段表現(xiàn)出不同的活性，以幼蟲(chóng)期活性最高，估計(jì)與幼蟲(chóng)期取食有關(guān)，因防御食物中可能存在的病原物、毒素或次生代謝物質(zhì)等的需要，使得幼蟲(chóng)期比其他發(fā)育階段保持有較高的凝集素水平[5].深入研究煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素的糖結(jié)合特性、凝集素類型及其理化特性等，對(duì)于揭示煙夜蛾免疫防御機(jī)理和實(shí)施有效防控等具有重要意義.因此，本研究采用糖抑制試驗(yàn)和血凝反應(yīng)，對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素的理化特性進(jìn)行了廣泛研究，以期為該類凝集素的分離、純化及豐富昆蟲(chóng)凝集素資源，深入探討昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的進(jìn)化等奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1昆蟲(chóng)飼養(yǎng)

在鄭州郊區(qū)煙田采集煙夜蛾卵，帶回室內(nèi)接種于人工飼料上.放置在(27±1)℃，光周期16L：8D，相對(duì)濕度60%～80%的人工氣候培養(yǎng)箱中，飼養(yǎng)至3齡幼蟲(chóng)初期后單頭分開(kāi)飼養(yǎng)至5齡.

1.2凝集活性測(cè)定

取煙夜蛾5齡幼蟲(chóng)收集血淋巴液，加入預(yù)先滴有少量苯基硫脲的冰浴離心管中，在4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液即血漿于-20 ℃保存.采集新鮮的鴨血放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)，用PBS沖洗3次，用PBS稀釋沉淀物并調(diào)至體積分?jǐn)?shù)為0.5%，4 ℃保存.參照OLUSOLA等[6]的方法，在96孔V型板上進(jìn)行血凝反應(yīng).以使紅細(xì)胞凝集活力的最大稀釋倍數(shù)為該凝集素樣品的凝集活力，記為2n(n為倍比稀釋的次數(shù))，以PBS作空白對(duì)照.

1.3血凝糖抑制試驗(yàn)

選用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-山梨糖和甘露糖9種單糖，蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖4種雙糖，分別用PBS磷酸緩沖溶液配制0.3 mol·L-1的糖溶液，參照朱呈智等[3]的方法進(jìn)行糖抑制試驗(yàn).

1.4不同因素對(duì)凝集活性的影響

1.4.1 EDTA和金屬離子影響的測(cè)定 將制備的15 μL煙夜蛾血漿倍比稀釋后，分別加入15 μL用PBS配制的10 mmol·L-1EDTA溶液，受EDTA抑制的血漿分別加入30 μL的0.1 mol·L-1的CaCl2，F(xiàn)eCl3·6H2O，KCl，MgCl2·6H2O溶液，測(cè)定凝集活性.

1.4.2 凍融循環(huán)影響的測(cè)定 將血漿樣品放入離心管中，在-20 ℃下保存30 min，然后將樣品移入15 ℃的水浴中處理15 min，使其融解.在同樣的條件下進(jìn)行2，4，8，10，12，16，18，20，24個(gè)重復(fù)的凍融循環(huán)，隨后加入體積分?jǐn)?shù)0.5%的鴨血紅細(xì)胞懸浮液測(cè)定活性.

1.4.3 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將血漿分別于25，37，60 ℃下處理15，60，120 min，以新鮮制備的血漿樣品為對(duì)照，測(cè)定各樣品的凝集活性.

1.4.4 pH值影響的測(cè)定 用磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-氫氧化鈉3種緩沖溶液，將血漿樣品的pH值調(diào)至2.2，3.0，4.0，4.92，6.24，7.17，8.34，8.67, 10.0，在4 ℃密封容器中放置2 h，然后將溶液的pH值調(diào)至7.4，測(cè)定其凝集活性.

1.4.5 胰蛋白酶影響的測(cè)定 取胰蛋白酶(3 U·mg-1)(Sigma公司產(chǎn)品)，用0.01 mol·L-1PBS磷酸緩沖液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶工作液.然后用該酶液修飾鴨血紅細(xì)胞，即在37 ℃溫育15 min，在2 500 r·min-1下離心10 min，棄上清液，用0.01 mol·L-1PBS磷酸緩沖液洗滌3次，以未經(jīng)胰蛋白酶修飾的鴨血紅細(xì)胞作為對(duì)照，分別測(cè)定樣品的凝集活性.

1.4.6 酚氧化酶影響的測(cè)定 取煙夜蛾5齡幼蟲(chóng)的血淋巴，在冰浴條件下分別放入有或無(wú)少量苯基硫脲的離心管中，分別測(cè)定凝集活性.

2 結(jié)果與分析

2.1糖專一結(jié)合特性

通過(guò)糖抑制試驗(yàn)比對(duì)供試糖類對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素凝集活性的抑制作用，得到表1結(jié)果.從表1可以看出，D-半乳糖、L-鼠李糖和乳糖對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素的凝集活性有完全抑制作用，L-阿拉伯糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖和山梨糖的抑制程度依次降低，而D-葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-巖藻糖、甘露糖和海藻糖則完全沒(méi)有抑制作用.說(shuō)明煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素具有與半乳糖、乳糖和鼠李糖專一結(jié)合的特性.

表1 13種糖對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)凝集素凝集活性的抑制作用Table 1 Inhibition effects of thirteen carbohydrates onthe hemagglutinating activity of the larval lectinsfrom H. assulta

注：“-”無(wú)凝集活性.下同。

Note: “-” means no hemagglutinating activity. The same as below.

2.2凝集素類型

煙夜蛾血淋巴凝集素對(duì)鴨血紅細(xì)胞的凝集活性很大程度受到EDTA的抑制.加入EDTA后，EDTA能夠螯合金屬離子，從而抑制依賴于金屬離子的凝集素的凝集活性，使得其凝集作用減弱(圖1).其中Ca2+,Fe3+和Mg2+都能使煙夜蛾血淋巴凝集素的凝集活力恢復(fù)，而K+,Na+沒(méi)有恢復(fù)能力，說(shuō)明煙夜蛾血淋巴凝集素產(chǎn)生凝集作用時(shí)需要Ca2+,或Fe3+和Mg2+的參與，而不需要K+和Na+.煙夜蛾血淋巴凝集素凝集活性依賴Ca2+，表明其屬C型凝集素.

圖1 金屬離子對(duì)煙夜蛾凝集素凝集活性的影響Fig.1 Effects of metal ions on the hemagglutinatingactivity of H. assulta lectins

2.3反復(fù)凍融對(duì)凝集素活性的影響

依次經(jīng)過(guò)2，4，8，10，12，16，18，20和24個(gè)凍融循環(huán)處理的煙夜蛾血淋巴與未經(jīng)凍融處理的血淋巴樣品均能引起鴨血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，并且凝集活力相當(dāng)，均為24，說(shuō)明經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融循環(huán)后，煙夜蛾血淋巴凝集素的凝集活性保持穩(wěn)定.

2.4溫度對(duì)煙夜蛾血淋巴凝集素凝集活性的影響

不同溫度處理和持續(xù)時(shí)間對(duì)煙夜蛾凝集素凝集活性的影響見(jiàn)表2.從表2可以看出，血淋巴樣品隨溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其凝素素的凝集活性呈下降趨勢(shì).在常溫25 ℃下，分別處理15，60，120 min后，其凝集活性相對(duì)穩(wěn)定.37 ℃處理15，60 min后其凝集活性亦無(wú)變化，而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，達(dá)120 min時(shí)其凝集活性下降，僅為對(duì)照的50%.隨著處理溫度的升高，血淋巴樣經(jīng)60 ℃處理僅15 min凝集活性便完全喪失，說(shuō)明煙夜蛾血淋巴凝集素的熱穩(wěn)定性較差.

表2 溫度對(duì)煙夜蛾血淋巴凝集素凝集活性的影響Table 2 Effects of temperature on the hemagglutinatingactivity of lectins

2.5pH值對(duì)煙夜蛾凝集素凝集活性的影響

不同pH值對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素活性的影響見(jiàn)表3.從表3可以看出，酸性極高環(huán)境使煙夜蛾血淋巴凝集素活性完全喪失.較酸或較堿的環(huán)境下凝集素活性均有不同程度的降低.而在中性條件下，保持最強(qiáng)的活性.相比而言，堿性環(huán)境對(duì)煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素活性的影響較酸性環(huán)境小.

2.6胰蛋白酶修飾鴨血紅細(xì)胞后對(duì)煙夜蛾凝集素活性的影響

煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素對(duì)經(jīng)胰蛋白酶修飾后的鴨血紅細(xì)胞的凝集作用顯著增強(qiáng)(表4)，凝集活性提高了15倍.顯然，正常鴨血紅細(xì)胞表面的凝集素受體因受到細(xì)胞膜外周蛋白或者糖肽的遮掩，一定程度上抑制了該受體與煙夜蛾血淋巴凝集素的結(jié)合，而當(dāng)這些糖蛋白被胰蛋白酶水解后，被覆蓋的糖基受體暴露出來(lái)，與相應(yīng)的凝集素結(jié)合，引起細(xì)胞凝集.因此，鴨血紅細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶修飾后使與煙夜蛾凝集素的凝集作用顯著提高.

表3 不同pH值對(duì)煙夜蛾凝集素凝集活性的影響Table 3 Hemagglutinating activities ofH. assulta at different pH

表4 胰蛋白酶修飾鴨血紅細(xì)胞后對(duì)凝集素活性的影響Table 4 The hemagglutination activity titers of H. assultalectins to duck erythrocyte treated with trypsin

2.7血淋巴酚氧化酶的影響

冰浴條件下，未加入苯基硫脲的煙夜蛾血淋巴樣品因酚氧化酶的作用很快發(fā)生黑化，而預(yù)先加入苯基硫脲的血淋巴樣品的黑化則受到抑制，2種情形下均能引起鴨血紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，且凝集效價(jià)均為27.由此說(shuō)明，血淋巴中酚氧化酶的存在并不影響煙夜蛾血淋巴凝集素的凝集活性.

3 結(jié)論與討論

3.1煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素糖專一結(jié)合特性

明確凝集素的糖專一結(jié)合特性，是研究凝集素特性的重要內(nèi)容.作為一種糖結(jié)合蛋白，不同凝集素結(jié)構(gòu)域中結(jié)合不同糖鏈的特性，使其能夠識(shí)別糖蛋白或糖脂，特別在識(shí)別和結(jié)合外源微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜中復(fù)雜碳水化合物中發(fā)揮重要作用.已有的研究表明，棉鈴蟲(chóng)血細(xì)胞凝集素Halectin擁有2個(gè)串聯(lián)排列的不同碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD1和CRD2，其中CRD1因含有EPD模體能結(jié)合甘露糖、半乳糖和脂多糖3種糖，CRD2因含有EPN模體具有比CRD1更寬的碳水化合物結(jié)合譜，能結(jié)合10種糖，包括木糖、甘露糖、半乳糖和麥芽糖等[7].家蠅Muscadomestica幼蟲(chóng)和蛹的凝集素相對(duì)分子量分別為38 kD和80 kD，均能特異性結(jié)合D-半乳糖，同屬于S型凝集素，對(duì)兔紅細(xì)胞均具有明顯凝集作用[8; 9].煙草天蛾Manducasexta幼蟲(chóng)凝集素IML-2具有2個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，通過(guò)C-末端的識(shí)別域進(jìn)行免疫應(yīng)答[10].本研究表明，煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素具有結(jié)合乳糖、半乳糖和鼠李糖的特性，這與大多數(shù)已報(bào)道的鱗翅目昆蟲(chóng)凝集素具有結(jié)合乳糖或半乳糖的特性相一致，表明作為模式識(shí)別受體的凝集素在該類群中具有對(duì)異物相同的結(jié)合位點(diǎn).

3.2煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素是C型凝集素

根據(jù)蛋白三維結(jié)構(gòu)以及一級(jí)序列的分析結(jié)果，將動(dòng)物凝集素分為4類：鈣離子依賴型的C型凝集素、半乳糖結(jié)合凝集素、P型凝集素和正五角蛋白凝集素[11]，而將巰基依賴型的S型凝集素歸為半乳糖結(jié)合的凝集素.鱗翅目昆蟲(chóng)的凝集素主要是C型凝集素，目前已從煙草天蛾幼蟲(chóng)中分離純化出4種凝集素，均為C型凝集素.其中，IML-1參與酚氧化酶原激活，以增強(qiáng)包囊反應(yīng)，Ca2+在其中起著重要作用[10].棉鈴蟲(chóng)C型凝集素在識(shí)別微生物表面的糖分子后，通過(guò)激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)來(lái)清除入侵的微生物[7].本研究得出的煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素同屬C型凝集素，其具體功能有待進(jìn)一步研究.

3.3不同因素對(duì)煙夜蛾凝集素凝集活性的影響

不同昆蟲(chóng)種類凝集素的理化性質(zhì)存在很大差異.已報(bào)道的谷實(shí)夜蛾Heliothiszea凝集素在凍融循環(huán)處理后凝集素活性降低，8個(gè)凍融循環(huán)后凝集素活性降低50%[6].昆蟲(chóng)凝集素作為一種糖蛋白或糖結(jié)合蛋白，其蛋白質(zhì)的活性不僅和它的一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，更和它的空間構(gòu)象相關(guān)，而在反復(fù)的凍融過(guò)程中，必定會(huì)引起維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的氫鍵、疏水鍵的強(qiáng)弱變化，從而引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化，而構(gòu)象一旦變化，可能會(huì)對(duì)其凝集活性產(chǎn)生影響.而煙夜蛾幼蟲(chóng)血淋巴凝集素經(jīng)過(guò)24個(gè)反復(fù)的凍融循環(huán)后，凝集素活性并未受到影響，這可能是它的空間構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定所致.昆蟲(chóng)為變溫動(dòng)物，其體內(nèi)凝集素生理活性的保持與溫度變化有密切關(guān)系，但不同來(lái)源凝集素的熱穩(wěn)定性也不盡相同.本研究測(cè)定的煙夜蛾凝集素在60 ℃便喪失了其凝集活性，說(shuō)明該凝集素的熱穩(wěn)定性差.而亞洲玉米螟幼蟲(chóng)血淋巴經(jīng)50 ℃處理30 min活性即明顯下降，70 ℃僅處理15 min活性完全喪失；家蠅凝集素有一定的熱穩(wěn)定性，經(jīng)65℃處理其凝集活性保持不變.一般認(rèn)為，凝集素?zé)岱€(wěn)定性的高低與凝集素的活性位點(diǎn)有關(guān)，若活性位點(diǎn)存在于對(duì)熱敏感的蛋白部分，則熱穩(wěn)定性差；反之，若凝集素的活性位點(diǎn)存在于比較耐高溫的糖分子上，則熱穩(wěn)定性就強(qiáng)[12].此外，凝集素在熱穩(wěn)定性方面的差異與凝集素分子的蛋白質(zhì)與糖的比例和空間分布也有一定關(guān)系[13].此外，凝集素活性還受pH值的影響，煙夜蛾凝集素在pH 4～10時(shí)均保持有凝集活性，而家蠅凝集素僅在pH 4～8范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，山蟬Cicadaflammata凝集素可在pH 2～13的范圍內(nèi)保持高的凝集活性.詳細(xì)研究不同昆蟲(chóng)凝集素的理化性質(zhì)，將有助于凝集素的分離、純化，為其生理功能的揭示奠定基礎(chǔ).

昆蟲(chóng)依賴凝集素參與異物識(shí)別和實(shí)施防御機(jī)能，而酚氧化酶作為昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的免疫蛋白，在昆蟲(chóng)的體液免疫和細(xì)胞免疫中均發(fā)揮著極其重要的作用.酚氧化酶與凝集素同為昆蟲(chóng)重要的免疫因子，本研究表明，血淋巴凝集素活性不受酚氧化酶黑化反應(yīng)的影響，這與黏蟲(chóng)的結(jié)果相一致[3]，說(shuō)明二者的存在均不影響彼此功能的發(fā)揮，這對(duì)于昆蟲(chóng)保持防衛(wèi)能力具有重要意義.2種免疫因子都可由血細(xì)胞合成，凝集素具有激活酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用，酚氧化酶參與黑化反應(yīng)，是黑色素形成的關(guān)鍵酶，因此，同作為昆蟲(chóng)免疫防御因子，二者功能的互補(bǔ)和協(xié)同就顯得極其重要.

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Studyonphysico-chemicalpropertiesofhemolymphlectinsinHelicoverpaassultalarvae

JING Xuan, ZHANG Li-fen, WANG Xiong-Ya, BAI Su-fen, LI Xin
(College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The physico-chemical properties ofHelicoverpaassultalarval lectins were investigated by comparing the inhibitory activity of thirteen sugars on the hemagglutination of the duck erythrocytes and hemagglutination reaction. The results indicated thatH.assultalectins could bind galactose, lactose, and rhamnose. The effects of different factors The effectson the hemagglutinating activity ofH.assultalectins were different. TheH.assultalectins were found to belong to the C-type (calcium-dependent) lectin family. The hemagglutinating activity was not influenced after repeated cycles of freezing and thawing, but it declined with increasing temperature and duration. All activity was lost at 60 ℃ for 15 min. The lectins had high hemagglutinating activity at pH 7.17. The agglutinin ability increased when duck erythrocytes were treated with trypsin. The hemagglutinating activity of lectins was not affected by the phenoloxidase-induced melanization reaction in the hemolymph. This suggested that lectins and phenoloxidase played synergistic effects in the humoral immune mechanisms of insects.

lectin; physico-chemical property;Helicoverpaassulta

1000-2340(2014)06-0721-05

Q96

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2014-03-25

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14B210034)

荊 譞，1988年生，男，河南鄭州人，碩士研究生，從事昆蟲(chóng)生理生化方面的研究.

白素芬，1968年生，女，山西平遙人，副教授，博士.