康利民，潘明新，高 毅，王康華，洪 合

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣州510280）

重癥急性胰腺炎（server acute pancreatitis，SAP）的死亡高峰主要是壞死的胰腺組織引起的繼發(fā)感染。繼發(fā)感染主要源于SAP腸黏膜屏障破壞引起的細(xì)菌易位［1］。動(dòng)物及臨床研究已經(jīng)證實(shí)，腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)（enteral nutrition，EN）支持對(duì)SAP腸屏障功能的保護(hù)作用［2－3］。腸內(nèi)免疫微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)（ecoimmunonutrition，EIN）支持是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新方式，本實(shí)驗(yàn)探討EIN對(duì)SAP大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量260～300g，分為對(duì)照組、EN組和EIN組，每組20只。采用逆行胰膽管緩慢注入4%牛黃膽酸鈉1mL／kg體質(zhì)量的方法制備SAP模型，對(duì)照組開腹后翻動(dòng)胰腺數(shù)次。SAP模型大鼠另選取空腸起始部約2 cm以下行空腸造口置入造瘺管并經(jīng)皮下隧道引出體外。

1.2 方法

1.2.1 方法 EN組：待大鼠清醒后4h，用少量等滲鹽水沖洗腸管，6h起腸道滴注腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑（華瑞公司生產(chǎn)），各組大鼠能量攝入126kJ·kg－1·d－1。EIN組：在EN組腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)乳劑中加入谷氨酰胺（L－Gln，成都藥業(yè)股份有限公司）0.4g·kg－1·d－1、精氨酸（L－Arg，上海信誼制藥廠）0.25g·kg－1·d－1、三聯(lián)活菌制劑（雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及腸球菌，上海信誼制藥廠）109CFU／d。對(duì)照組正常飲食、飲水。3組大鼠7d后經(jīng)腹腔麻醉處死，心臟取血備用。取胰腺、空腸甲醛及戊二醛固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 血清淀粉酶采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定；血漿內(nèi)毒素測(cè)定采用動(dòng)態(tài)比濁法，內(nèi)毒素檢測(cè)用水購(gòu)自天津一瑞生物工程有限公司；D－乳酸采用酶學(xué)分光光度法檢測(cè)，D－乳酸標(biāo)準(zhǔn)液及右旋乳酸脫氫酶（D－LDH）購(gòu)自Sigma公司；二胺氧化酶（DAO）采用活性比色法測(cè)定，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥有限公司；取胰腺及距幽門10cm處小腸約2 cm，常規(guī)甲醛固定光鏡病理檢查，測(cè)20個(gè)小腸絨毛的絨毛高度并計(jì)算小腸黏膜厚度。參照文獻(xiàn)［4］將小腸黏膜損傷分為6級(jí)，比較3組小腸病理學(xué)評(píng)分；另取約2cm小腸，2.5%戊二醛溶液固定并乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，亞甲藍(lán)染色光鏡下定位后，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，JEM－200EX（JEOL公司）透射電鏡下觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物存活情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，EN組有3只大鼠分別于術(shù)后45min、16h、4d死亡，EIN組1只大鼠于術(shù)后3d死亡，以上4只大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未進(jìn)入統(tǒng)計(jì)。

2.2 血清淀粉酶、內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平變化EN組、EIN組血清淀粉酶、內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；EIN組內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平較EN組明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），兩組血清淀粉酶無(wú)明顯差異，見表1。

2.3 胰腺和小腸組織病理學(xué)變化 對(duì)照組胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整無(wú)明顯改變；EN組胰腺組織出血、壞死，腺體結(jié)構(gòu)消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和胰周組織脂肪壞死；EIN組可見胰腺小葉結(jié)構(gòu)欠完整，輕度水腫、出血，組織間隙略增寬，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）；對(duì)照組空腸黏膜完整，空腸絨毛無(wú)水腫，排列整齊；EN組空腸黏膜上皮糜爛，大片壞死，脫落及缺損，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛樣結(jié)構(gòu)減少；EIN組空腸黏膜表現(xiàn)輕度水腫，片狀壞死，絨毛部分脫落及倒伏，見圖2。

表1 血清淀粉酶、內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平比較±s）

表1 血清淀粉酶、內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平比較±s）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與 EN 組比較。

組別 n 淀粉酶（IU／L）內(nèi)毒素（pg／L）D－乳酸（μg／mL）DAO（μg／mL）150±35 7.91±2.13 3.94±1.17 14.27±2.53 EN組 17 1 629±91a41.45±3.27a11.35±1.34a81.27±3.46a EIN組 19 1 521±87a18.57±2.51ab 6.64±1.47ab 21.67±6.72對(duì)照組 20 ac

圖1 各組大鼠胰腺病理學(xué)變化（HE×100）

圖2 各組大鼠腸道病理學(xué)變化（HE×100）

2.4 小腸黏膜厚度、絨毛高度及腸上皮損傷指數(shù)的變化 EN組、EIN組大鼠小腸黏膜厚度和絨毛高度均較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），小腸上皮損傷指數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；EIN組小腸黏膜厚度和絨毛高度較EN組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），而小腸上皮損傷指數(shù)較EN組明顯減低（P＜0.01），見表2。

表2 小腸黏膜厚度、絨毛高度計(jì)腸上皮損傷指數(shù)比較±s）

表2 小腸黏膜厚度、絨毛高度計(jì)腸上皮損傷指數(shù)比較±s）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與 EN 組比較。

組別 n 黏膜厚度（μm） 絨毛高度（μm）20 669.78±63.51 37.29±5.92 0.82±0.31 EN組 17 369.37±28.52a16.43±4.73a 3.95±0.74a EIN組 19 486.30±37.28ab 21.47±3.60ac 2.81±0.36腸上皮損傷指數(shù)對(duì)照組ab

圖3 各組大鼠腸道電鏡變化（×10 000）

2.5 小腸組織電鏡結(jié)構(gòu)變化 電鏡觀察下對(duì)照組小腸黏膜上皮細(xì)胞表面微絨毛排列整齊，柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)未見異常，固有層腺體結(jié)構(gòu)及各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；EN組小腸黏膜線粒體高度腫脹，嵴缺失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，上皮細(xì)胞微絨毛稀疏、部分缺如，細(xì)胞萎縮，大量細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)邊聚；EIN組小腸黏膜上皮細(xì)胞表面微絨毛排列有輕度線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，上皮細(xì)胞微絨毛排列略不規(guī)整，見圖3。

3 討 論

近年來(lái)的研究表明，腸道不僅是消化吸收的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是急性應(yīng)激反應(yīng)的中心器官及多器官功能衰竭的始動(dòng)器管［5］。腸道作為體內(nèi)最大的細(xì)菌和內(nèi)毒素庫(kù)，腸黏膜屏障功能的完整性對(duì)抵抗腸源性細(xì)菌易位具有重要的作用。腸道細(xì)菌易位導(dǎo)致的胰腺壞死繼發(fā)感染是SAP的主要死因之一。所以探索維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能的有效方法是目前SAP研究的熱點(diǎn)之一。

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障及化學(xué)屏障4部分組成，而腸黏膜通透性是評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能的重要指標(biāo)。劉中輝等［6］研究發(fā)現(xiàn)，SAP早期的腸黏膜破壞導(dǎo)致腸道通透性明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，EN及EIN組小腸黏膜厚度、絨毛高度及腸上皮損傷指數(shù)均有差異，亦證明SAP大鼠小腸存在腸道黏膜的損傷，然EIN組大鼠小腸的空腸光鏡變化、病理學(xué)評(píng)分及電鏡超微結(jié)構(gòu)改變均較EN組輕微，提示應(yīng)用腸內(nèi)免疫微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)能較有效保護(hù)腸道，維護(hù)腸道黏膜屏障的完整性。

EIN是在普通EN的基礎(chǔ)上添加將谷氨酰胺、精氨酸、益生菌等有免疫促進(jìn)及調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的特殊營(yíng)養(yǎng)素。動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)表明，EIN可通過(guò)不同機(jī)制協(xié)助保護(hù)腸黏膜屏障［7］，抑制腸道菌群失調(diào)，減輕全身炎性反應(yīng)，提高機(jī)體免疫，降低SAP的感染率［8－10］。D－乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸道通透性增加時(shí)腸道中細(xì)菌產(chǎn)生大量D－乳酸通過(guò)受損黏膜入血使血漿D－乳酸水平升高，故檢測(cè)血漿D－乳酸水平可及時(shí)反映腸壁通透性變化［11］。DAO是腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在腸黏膜細(xì)胞受損、壞死后該酶釋放入血或隨壞死脫落的腸黏膜細(xì)胞進(jìn)入腸腔內(nèi)，可通過(guò)測(cè)定其在外周血中變化，作為反映腸黏膜完整性相對(duì)穩(wěn)定的生化指標(biāo)［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EN組及EIN組血清內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平均增高，說(shuō)明SAP時(shí)存在內(nèi)毒素血癥、腸道通透性增高。而EIN組血清內(nèi)毒素、D－乳酸及DAO水平明顯低于EN組（P＜0.01或P＜0.05），提示應(yīng)用EIN能有效保護(hù)腸道，減少腸道的通透性，維護(hù)腸黏膜屏障的完整性，降低SAP大鼠內(nèi)毒素血癥。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多角度、多指標(biāo)的研究，論證了EIN對(duì)SAP大鼠具有降低空腸的通透性，減少菌群移位，有助于對(duì)腸屏障功能的保護(hù)作用。當(dāng)然其具體作用方式及機(jī)制還需進(jìn)一步深入地研究。

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