翁琴云+++游小偉+++張建梅+++黃建煒

[摘要] 目的 建立廈門市副溶血性弧菌分離株的脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）數(shù)據(jù)庫(kù)，分析不同來(lái)源菌株的同源性關(guān)系。 方法 203株菌株的基因組DNA經(jīng)SfiⅠ酶切、脈沖場(chǎng)電泳后，利用Bionumerics軟件分析電泳圖譜。 結(jié)果 203株菌株可分成149種不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有獨(dú)特的帶型，同時(shí)也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多。對(duì)于日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株，PFGE分型結(jié)果與水產(chǎn)品的種類、采樣時(shí)間基本無(wú)相關(guān)性，79個(gè)菌株可分成74個(gè)PFGE帶型；從歷年食物中毒應(yīng)急監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株，其PFGE型相對(duì)較少，124株中只有76個(gè)PFGE型。應(yīng)用Bionumerics計(jì)算D值為99.81%。 結(jié)論 建立了廈門市副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)，為本市副溶血性弧菌的監(jiān)測(cè)和疫情的應(yīng)急處理提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 副溶血性弧菌；脈沖場(chǎng)凝膠電泳；分子分型

[中圖分類號(hào)] R378.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）08（a）-0007-04

Molecular analysis and database establishment of Vibrio parahaemolyticus by pulsed field gel electrophoresis in Xiamen

WENG Qin-yun YOU Xiao-wei ZHANG Jian-mei HUANG Jian-wei

Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City，Xiamen 361021，China

[Abstract] Objective To establish pulsed field gel electrophoresis（PFGE）database of Vibrio parahaemolyticus and to analyse the homology during the strains from different sources. Methods The DNA samples of 203 Vibrio parahaemolyticus strains were digested with SfiⅠand then were analyzed by PFGE and bionumerics software. Results 203 strains were divided into 149 distinctive PFGE patterns 91.13% （185 strains） of strains owned unique PFGE pattern，and a few of strains owned more strains.79 strains from surveillance were divided into 74 PFGE patterns，which indicated that there was no relationship between the typing results and aquatic product，sampling time.124 strains from food poisoning were divided into 76 PFGE patterns.The D value was 99.81% calculated by bionumerics software. Conclusion The PFGE database of Vibrio parahaemolyticus in Xiamen is established，which providing scientific basis for surveillance and emergency response of Vibrio parahaemolyticus in the city.

[Key words] Vibrio parahaemolyticus；Pulsed field gel electrophoresis；Molecular typing

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性弧菌，廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中，進(jìn)食含有該菌的食物，可引起嚴(yán)重的胃腸炎反應(yīng)[1]，目前是我國(guó)沿海地區(qū)常見的食物中毒病原菌。脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術(shù)是一種非常重要且應(yīng)用廣泛的分子分型技術(shù)，可用于評(píng)價(jià)副溶血性弧菌菌株之間的遺傳多樣性及來(lái)源于環(huán)境的菌株與分離自患者菌株的相關(guān)性[2-3]。廈門地處沿海，在食源性致病菌日常監(jiān)測(cè)中經(jīng)?？蓮耐猸h(huán)境各種水體和水產(chǎn)品中分離到副溶血性弧菌菌株，同時(shí)在本地暴發(fā)的多起食物中毒應(yīng)急檢測(cè)中分離得到副溶血性弧菌菌株。本項(xiàng)目采用PFGE技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室歷年從日常檢測(cè)與食物中毒應(yīng)急事件中分離得到的203株副溶血性弧菌菌株進(jìn)行分析研究，建立廈門市副溶血性弧菌PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于從分子水平上了解本市副溶血性弧菌的環(huán)境菌株與分離自患者菌株的特征及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株

2005年5月～2012年11月本實(shí)驗(yàn)室在日常監(jiān)測(cè)及食物中毒中分離得到的203株副溶血性弧菌分離株，其中有79株是在日常監(jiān)測(cè)中分離得到，另外124株是在歷年的食物中毒應(yīng)急檢測(cè)中分離得到。

1.2 主要試劑和儀器

蛋白酶K（Merck公司）；脈沖場(chǎng)電泳級(jí)瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（Lonza公司）；限制性內(nèi)切酶：SfiⅠ、XbaⅠ（NEB公司）；脈沖場(chǎng)電泳儀為CHEF MAPPER（Bio-Rad公司）；Densimat細(xì)菌濁度儀（BioMerieux公司）；凝膠成像儀為Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)PulseNet網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PFGE實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 膠塊制備 從檢測(cè)培養(yǎng)基上挑取單菌落，無(wú)菌接種于3% TSA平板上，37℃培養(yǎng)14～18 h。從培養(yǎng)皿上刮取適量細(xì)菌，均勻懸濁于細(xì)胞懸浮液（CSB）中于濁度儀上調(diào)整細(xì)菌的濃度，使OD值為4～4.5。取400 ml菌懸液加入終濃度為0.5 mg/ml蛋白酶K進(jìn)行消化，再加入等體積1% SeaKem Gold Agarose，混勻灌制膠塊。

1.3.2 細(xì)胞裂解和膠塊的洗滌 凝固后膠塊加入細(xì)胞裂解液（CLB）/蛋白酶K混合液，置于54℃水浴輕搖2 h后，用50℃預(yù)熱的滅菌超純水洗滌2次，再用50℃預(yù)熱TE緩沖液洗滌4次。

1.3.3 膠塊DNA酶切 切取2 mm寬的副溶血性弧菌膠塊，用SfiⅠ酶處理，于50℃酶消化4 h，沙門菌H9812用XbaⅠ酶切，于37℃酶消化4 h。

1.3.4 加樣和電泳 將酶切后的膠塊直接粘在梳子齒上，向膠槽中注入100 ml溶化的1% SeaKem Gold Agarose，待膠凝固后進(jìn)行電泳。設(shè)置電泳緩沖液的溫度為14℃，電泳參數(shù)：78～396 kb、10～35.3 s、19 h。

1.3.5 圖像獲取及數(shù)據(jù)分析 電泳結(jié)束后，將膠放入Gelred染料中染色，脫色后用Gel Doc XR+成像，使用BioNumerics（6.6.4）軟件，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法，設(shè)置tolerance為1.5%，對(duì)PFGE圖譜進(jìn)行處理和聚類分析。同時(shí)，使用Simpson差異指數(shù)（D值）對(duì)PFGE分型結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中的菌株帶型均按照國(guó)際PulseNet的帶型命名原則進(jìn)行命名。

2 結(jié)果

2.1 PFGE分型結(jié)果

203株副溶血性弧菌經(jīng)過(guò)PFGE分析，獲得149個(gè)不同的PFGE帶型，命名為VPAS12.XM0001～VPAS 12.XM0149。圖1是每個(gè)PFGE型各選取1個(gè)代表株的聚類圖，可看出DNA條帶分子量主要集中于30～700 kb，酶切條帶數(shù)為14～21。優(yōu)勢(shì)型別有VPAS12.XM0105，共含有14個(gè)菌株；VPAS12.XM0124含有8個(gè)菌株；VPAS12.XM0113、VPAS12.XM0121、VPAS12.XM0125，都含有6個(gè)菌株；VPAS12.XM011有4個(gè)菌株。優(yōu)勢(shì)型別所含有的絕大多數(shù)菌株都是從食物中毒應(yīng)急檢測(cè)中分離得到，只有VPAS12.XM0105中有1個(gè)菌株來(lái)源于日常監(jiān)測(cè)。應(yīng)用Bionumerics計(jì)算D值為99.81%。

2.2 對(duì)廈門副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)總體描述

將本實(shí)驗(yàn)中所獲得的203株副溶血性弧菌的PFGE圖譜，全部錄入Bionumerics軟件中，建立了廈門市副溶血性弧菌的PFGE數(shù)據(jù)庫(kù)。整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共包含79株從日常監(jiān)測(cè)中分離得到菌株及124株從歷年食物中毒應(yīng)急檢測(cè)中分離得到的菌株，共獲得149個(gè)PFGE型別，其中91.13%（185株）的菌株具有獨(dú)特的帶型，同時(shí)也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多，含有最多菌株（14株）的優(yōu)勢(shì)型別只有VPAS12.XM0105（圖2）。

圖2 各種PFGE帶型包含的菌株數(shù)分布情況

從菌株來(lái)源看，對(duì)于日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株，PFGE分型結(jié)果與水產(chǎn)品的種類、采樣時(shí)間基本無(wú)相關(guān)性，79個(gè)菌株可分成74個(gè)PFGE帶型，各帶型包含的菌株數(shù)最多3個(gè)菌株。對(duì)于從歷年食物中毒應(yīng)急監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株，其PFGE型相對(duì)較少，124株中只有76個(gè)PFGE型，各帶型包含的菌株數(shù)最多13個(gè)菌株（表1）。

表1 副溶血性弧菌2種不同來(lái)源的菌株P(guān)FGE帶型的情況描述

3 討論

應(yīng)用傳統(tǒng)的血清型分型和噬菌體分型方法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行分型，只能進(jìn)行表型鑒定，存在分辨力、靈敏度不高等諸多缺陷[4]，PFGE分型方法是一種基于基因水平的分子分型方法，因其具有高分辨力、可重復(fù)性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)，目前已成為分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。1996年在美國(guó)首先成立的PulseNet網(wǎng)絡(luò)就是利用標(biāo)準(zhǔn)化的分子分型技術(shù)（PFGE技術(shù)是其中最重要的方法之一），通過(guò)菌株“指紋圖譜”或序列資料的比對(duì)分析，識(shí)別傳染病病例間的內(nèi)在遺傳關(guān)聯(lián)，進(jìn)而追溯傳染病暴發(fā)來(lái)源和傳播途徑[5]。美國(guó)PulseNet成立之后，多次對(duì)以食源性病原體為主的細(xì)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，且在多次食物中毒的調(diào)查中發(fā)揮了良好作用[6-8]。PulseNet China自2004年成立之后，也先后參與國(guó)內(nèi)外多個(gè)疫情的協(xié)查與處理[6]，因此，本研究在預(yù)防和控制突發(fā)食源性疾病公共衛(wèi)生事件中意義重大。

本項(xiàng)目中203株菌株可分成149種不同的PFGE型，91.13%（185株）的菌株具有獨(dú)特的帶型，同時(shí)也有少數(shù)帶型包含的菌株數(shù)較多，但包含最多的優(yōu)勢(shì)型別VPAS12.XM0105，也只含有14個(gè)菌株，其中只有1個(gè)菌株是來(lái)源于日常監(jiān)測(cè)。79個(gè)菌株可分成74個(gè)PFGE帶型，各帶型包含的菌株數(shù)最多3個(gè)菌株。眾多型別的出現(xiàn)，說(shuō)明了從日常監(jiān)測(cè)中得到的廈門地區(qū)副溶血性弧菌菌株存在遺傳多樣性，而且變異度較大，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[2，9-10]。個(gè)別菌株間存在同源性，其中FJXM11VPA004和FJXM11VPA006圖譜完全相同，屬于同一個(gè)帶型，命名為VPAS12.XM0096。這兩個(gè)菌株采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)、采樣種類都不一樣，提示可能有相同的污染來(lái)源，所以仍應(yīng)加強(qiáng)對(duì)副溶血性弧菌的日常監(jiān)測(cè)，從而有效預(yù)防食源性疾病的發(fā)生。對(duì)于從歷年食物中毒應(yīng)急監(jiān)測(cè)中分離得到的124株菌株，其聚類分析結(jié)果表明，各個(gè)菌株之間的相似度較高，總的可分成76個(gè)PFGE型，同一次食物中毒應(yīng)急檢測(cè)中分離得到的菌株，其指紋圖譜大多數(shù)一致或高度相似，但也有的指紋圖譜相差較大，這與食物中毒是由單一血清型感染或多血清感染具有很大關(guān)系。研究表明，食物中毒中同一患者分離到多種血清型，不同患者分離到不同種血清型[11-12]或剩余食品和患者可以分離到不同血清型的副溶血性弧菌均有可能[13-14]。

從菌株來(lái)源來(lái)看，79株從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個(gè)從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測(cè)中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無(wú)關(guān)。

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（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）

從菌株來(lái)源來(lái)看，79株從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個(gè)從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測(cè)中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無(wú)關(guān)。

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（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）

從菌株來(lái)源來(lái)看，79株從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與124株從歷年食物中毒事件中分離得到的菌株，兩者的菌株指紋圖譜總體上存在顯著差異，只有1個(gè)從日常監(jiān)測(cè)中分離得到的菌株與食物中毒的菌株一致，可見，這些在日常監(jiān)測(cè)中分離得到的副溶血性弧菌與本地暴發(fā)的疫情無(wú)關(guān)。

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（收稿日期：2014-05-07 本文編輯：李亞聰）